Διερεύνηση και ανάλυση της επιγενετικής ρύθμισης των λειτουργιών των αιμοποιητικών στελεχιαίων κυττάρων του ανθρώπου

Abstract

The mammalian hematopoietic system is comprised of more than 10 distinct cell types. All are derived from a common progenitor cell, the hematopoietic stem cell (HSC). The HSCs are defined by two main functions; the multilineage differentiation to all terminal blood cell types and their ability to sustain the hematopoietic system through the entire life of an individual through self-renewal. These two features, multilineage differentiation and self-renewal render HSCs both a formidable clinical tool as well as the ideal model for stem cell biology. This work addresses both these features of human HSCs in three experimental approaches. The first one evaluates the efficacy of ex vivo maintenance and expansion of HSCs in the presence of different small chemical molecules and aims at the development of an optimized protocol for ex vivo HSC expansion. HSCs were maintained in the culture under the different conditions and the effect of the small molecules on the immunophenotype of expanded HSCs was investigated. Furthermore, the functional differences as a result of the expansion regimens were studied by assessing the capacity of expanded HSC to repopulate irradiated bone-marrow as well as their multilineage differentiation potential through transplantation experiments in relevant mouse models. Additionally, RNAseq analysis of the differentially expanded populations identifies the transcriptional changes in response to the different expansion protocols tested. Taking into consideration this information, a novel optimized protocol for the ex vivo expansion of human HSC is proposed. The second approach aims at elucidating the epigenetic regulatory landscape during the differentiation of human HSCs into erythrocytes. Dense time-course of chromatin accessibility with DNase I-seq and gene expression using total RNAseq resulted in high resolution maps of the developmentally responsive DNase I Hypersensitive Sites (DHS) and genes during erythropoiesis. Subsequently, the temporal interactions between individual DHS and genes during development are investigated using mathematical modelling, resulting in the identification of epigenetic regulatory modules implicated in lineage commitment and differentiation. Assessment of clonogenic capacity and lineage potential of the differentiating populations along erythropoiesis confirms the existence of discrete functional states that correspond to the regulatory modules identified. Finally, bioinformatic analysis of the single-cell transcriptional dynamics of the populations during erythroid-megakaryocytic development identify distinct populations of progenitor cells and how these diverge during lineage commitment. Finally, the third experimental approach attempts to identify and isolate progenitor populations with defined linage potential. Using single-cell flow-cytometric index sorting, individual hematopoietic progenitor cells are interrogated for both their immunophenotype and their differentiation potential. This resulted in the development of a comprehensive set of cell-surface markers able to discriminate functionally distinct progenitors. Finally, a novel cell-surface marker is identified that can distinguish erythroid progenitors.

Στο αιμοποιητικό σύστημα των θηλαστικών, απαντώνται πάνω από 10 διακριτοί διαφοροποιημένοι τύποι κυττάρων και όλοι προέρχονται από έναν προγονικό αιμοποιητικό κυτταρικό τύπο, το αρχέγονο αιμοποιητικό στελεχιαίο κύτταρο (Hematopoietic Stem Cell, HSC). Τα HSCs, πέραν από τη δυνατότητά τους να διαφοροποιούνται προς όλες τις αιμοποιητικές σειρές (πολυγραμμική διαφοροποίηση), είναι αυτά τα οποία συντηρούν ολόκληρο το αιμοποιητικό σύστημα εφ’ όρου ζωής χάρη στην ικανότητά τους να διατηρούν σταθερό τον πληθυσμό τους μέσω της αυτό-ανανέωσης (self-renewal). Αυτά τα δύο λοιπόν χαρακτηριστικά, η αυτό-ανανέωση και η πολυγραμμική διαφοροποίηση είναι αυτά που καθιστούν τα HSCs ένα ισχυρό κλινικό εργαλείο, καθώς και το κατάλληλο μοντέλο για τη βιολογία των στελεχιαίων κυττάρων. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η διερεύνηση των επιγενετικών, κατά βάση, μηχανισμών που συμμετέχουν στις δύο αυτές λειτουργίες των HSCs του ανθρώπου. Αρχικά, διερευνήθηκαν μέθοδοι ex vivo έκπτυξης των HSCs με την επίδραση μικρών χημικών μορίων (small molecules) και επιδιώχθηκε η ανάπτυξη πρωτοκόλλου που επιτρέπει την βέλτιστη έκπτυξη τους. Μελετήθηακν οι επιδράσεις των μορίων αυτών τόσο στο φαινότυπο των HSCs όσο και στην ικανότητα ενοίκησης ανοσοκατεσταλμένου μυελού των οστών, και διαφοροποίησης με πειράματα ξενο-μεταμόσχευσης σε σχετικό ζωικό μοντέλο. Εν συνεχεία, μελετήθηκαν οι διαφορές στο μεταγραφικό επίπεδο με αλληλούχηση μεταγραφώματος RNAseq και βιοπληροφορική ανάλυση ενώ τέλος ταυτοποιήθηκε ένας συνδυασμός μορίων για την βέλτιστη έκπτυξη των HSCs. Στο δεύτερο σκέλος της εργασίας, διερευνήθηκε η δυναμική του επιγενετικού τοπίου που συμμετέχει στην διαφοροποίηση των HSCs του ανθρώπου προς την ερυθρά σειρά. Αναλύθηκε η προσβασιμότητα χρωματίνης με DNase I-seq και οι μεταγραφικές διαφορές με RNAseq κατά την ex vivo επαγωγή της ερυθροποίησης και δημιουργήθηκαν γενετικοί χάρτες με όλα τα ρυθμιστικά στοιχεία (DNase I Hypersensitive Sites, DHS) και τα γονίδια τα οποία συμμετέχουν κατά την ερυθροποίησης. Εν συνεχεία, με τη χρήση μαθηματικών μοντέλων μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ DHS και γονιδίων και πως αυτές μεταβάλλονται κατά τη διαφοροποίηση και ταυτοποιήθηκαν επιγενετικές λειτουργικές δομές που συμμετέχουν στους μηχανισμούς διαφοροποίησης και δέσμευσης στην εκάστοτε κυτταρική σειρά. Πειράματα πολυγραμμικής διαφοροποίησης και κλωνογενούς ικανότητας των κυττάρων κατά την ερυθροποίηση καταδεικνύουν την ύπαρξη διακριτών λειτουργικών σταδίων κατά την διαφοροποίηση, ενδεικτικών των επιγενετικών λειτουργικών δομών που ταυτοποιήθηκαν νωρίτερα. Τέλος, διερευνήθηκαν οι μεταβολές των πληθυσμών των προγονικών κυττάρων στο μεταγραφικό επίπεδο κατά τον διαχωρισμό της ερυθροειδικής και μεγακαρυοκυτταρικής σειράς με ανάλυση του μεταγραφώματος σε μονήρη κύτταρα (single-cell RNAseq) με βιοπληροφορική ανάλυση. Στο τρίτο και τελευταίο σκέλος, έγινε προσπάθεια απομόνωσης των αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων με διαφορικό δυναμικό διαφοροποίησης προς τις διάφορες αιμοποιητικές σειρές. Με τη χρήση μεθόδων απομόνωσης μονήρων κυττάρων με κυτταρομετρία ροής και πειραμάτων κλωνογενούς ικανότητας και πολυγραμμικής διαφοροποίησης ταυτοποιήθηκαν προγονικά κύτταρα με συγκεκριμένο διαφοροποιητικό δυναμικό και διακριτό ανοσοφαινότυπο. Τέλος, προτείνεται μια σειρά από δείκτες επιφανείας ικανοί να τα διαχωρίσουν τους διάφορους προγονικούς τύπους βάσει του διαφοροποιητικού τους δυναμικού, ενώ ταυτοποιούνται νέοι δείκτες που ικανοί να διαχωρίσουν τους προγόνους της ερυθράς σειράς.