The role of Synphilin-1A/PPP1 complex in Lewy bodies formation

Abstract

One of the major Parkinson’s disease hallmarks is the development of cytoplasmic inclusions, termed Lewy bodies, mainly within surviving neurons in the brainstem of affected patients. Many proteins have been identified in the Lewy bodies, but their formation mechanism remains unclear. Among the proteins already identified in the Lewy bodies are synphilin-1, a α-synucleininteracting protein, and synphilin-1A, a synphilin-1 splice variant. Synphilin-1 and synphilin-1A have been considered key elements in Parkinson’s disease as their overexpression in human embryonic kidney 293 cells, with or without α-synuclein, leads to the formation of Lewy body-like cytoplasmic inclusions. Therefore, efforts have been made to clarify the regulatory mechanisms behind synphilin-1 and synphilin-1A aggregation as a means to uncover new aspects of Lewy bodies formation. Although kinases able to phosphorylate synphilin-1 have been described, there are no specific data concerning the phosphatases responsible for its dephosphorylation. This gap was filled with the identification of synphilin-1A as a novel phosphoprotein phosphatase 1-interacting protein in human brain, through yeast two hybrid. Hence, in the present work, the physiological role of synphilin-1A/phosphoprotein phosphatase 1 complex is studied, being demonstrated the ability of synphilin-1A to specifically target phosphoprotein phosphatase 1 to inclusion bodies, using immunofluorescence experiments. Moreover, the consequences of disrupting this interaction are explored using a synphilin-1A mutant unable to interact with phosphoprotein phosphatase 1, revealing an enhancement of synphilin-1A aggregative properties. Also, the ability of wild type synphilin-1A and the mutant form to produce aggresomes upon overexpression and without proteasome inhibition is addressed but the results are unclear, does not allowing the classification of the inclusions documented in this work as aggresomes. All together, these results suggest that synphilin-1A is able to affect phosphoprotein phosphatase 1 targeting within cells, being inclusion bodies formation dependent and, most specifically, controlled by phosphoprotein phosphatase 1 activity. It is postulated that decreased phosphoprotein phosphatase 1 recruitment to inclusion bodies produces hyperphosphorylated states that favor protein aggregation.

Uma das características principais da doença de Parkinson é o aparecimento de inclusões citoplasmáticas, chamadas corpos de Lewy, maioritariamente nos neurónios dopaminérgicos remanescentes, no tronco cerebral dos pacientes afetados. Várias proteínas têm sido identificadas nos corpos de Lewy, mas o seu mecanismo de formação permanece por clarificar. Entre as várias proteínas já identificadas encontram-se a sinfilina-1, uma proteína interactora da α-sinucleina, e a sinfilina-1A, uma variante da sinfilina-1. Ambas têm sido consideradas elementos chave na doença de Parkinson, já que a sua sobreexpressão em células embrionárias 293 de rim humano, com ou sem a α-sinucleina, conduz à formação de inclusões citoplasmáticas parecidas com corpos de Lewy. Posto isto, têm sido envidados esforços no sentido de clarificar os mecanismos reguladores da agregação da sinfilina-1 e da sinfilina- 1A, como forma de revelar novos aspetos da formação dos corpos de Lewy. Embora tenham sido descritas cinases capazes de fosforilar a sinfilina-1, não há informações concretas sobre as fosfatases responsáveis pela sua desfosforilação. Este vazio começou a ser preenchido com a identificação da sinfilina-1A como uma nova proteína interactora da fosfoproteína fosfatase 1 em cérebro humano, através do sistema dois híbrido de levedura. Deste modo, no presente trabalho, procede-se ao estudo da função fisiológica do complexo sinfilina-1A/fosfoproteína fosfatase 1, demonstrando-se a capacidade da sinfilina-1A de recrutar de forma específica a fosfoproteína fosfatase 1 para corpos de inclusão, com recurso a imunofluorescência. Adicionalmente, as consequências do bloqueio desta interação são exploradas utilizando um mutante da sinfilina-1A incapaz de interagir com a fosfoproteína fosfatase 1, revelando um aumento das propriedades agregativas da sinfilina-1A. Finalmente, também é avaliada a capacidade de a sinfilina-1A selvagem e mutada produzirem agressomas, quando sobreexpressas e sem inibição do proteassoma, mas os resultados não são claros e não permitem a classificação das inclusões documentadas no presente trabalho como agressomas. Em conjunto, estes resultados sugerem que a sinfilina-1A tem a capacidade de afetar o endereçamento da fosfoproteína fosfatase 1 nas células, sendo a formação de corpos de inclusão dependente e, mais concretamente, controlada pela atividade da fosfoproteína fosfatase 1. Postulase que um menor endereçamento da fosfoproteína fosfatase 1 para os corpos de inclusão conduza a estados hiperfosforilados que favorecem a agregação proteica.