Estudo da expressão da proteína LRP1B em tumores de ovário

Abstract

O LRP1B (Recetor de lipoproteína de baixa densidade ligado à proteína 1B), pertencente à superfamília de recetores de lipoproteína de baixa densidade, interage com vários ligandos e serve como mediador da endocitose. O seu gene está descrito como sendo um dos 10 genes mais deletados em cancro. Embora o papel do LRP1B no cancro não seja ainda totalmente claro, pensa-se que a sua atividade endocítica possa desempenhar um papel importante na modulação da disponibilidade de fatores no microambiente tumoral. Pode ainda intervir na internalização de fármacos e assim contribuir para a resistência de terapias lipossomais, como por exemplo à doxorrubicina lipossomal em cancro de ovário. A maioria dos estudos sobre a disfunção do LRP1B têm por base a análise de DNA/RNA. Embora haja alguns estudos que referem a utilização de anticorpos para a deteção da proteína LRP1B, a informação é ainda escassa, provavelmente devido à pouca informação sobre os anticorpos utilizados e ao facto do LRP1B ser uma proteína de elevado peso molecular, codificada por um cDNA longo difícil de clonar. Nos últimos anos, novos anticorpos para o LRP1B têm começado a aparecer o que poderá ajudar na melhor caracterização da função desta proteína em cancro. Assim, este projeto teve como objetivo principal a análise da expressão e localização de LRP1B em carcinoma de ovário com recurso a anticorpos comerciais, usando as metodologias de Western blot e imunohistoquímica (IHQ). Pretendeu-se ainda com este trabalho adquirir competências em cultura celular de linhas celulares tumorais humanas e em metodologias de análise da resposta a fármacos usando, como modelo, linhas celulares de carcinoma de ovário com sobre-expressão de LRP1B. Se por um lado, não foi possível avaliar a expressão de LRP1B em linhas celulares tumorais de ovário por Western blot (devido à inespecificidade dos anticorpos usados nas condições testadas) por outro lado, os resultados obtidos com a metodologia de IHQ foram bastante positivos. De facto, foi possível não só a otimização dos anticorpos como também o seu uso na análise da expressão do LRP1B em cancro de ovário. Foi analisada uma série de amostras de carcinoma de ovário obtidas de pacientes sujeitas a tratamento com quimioterapia que incluía dois grupos: um de pacientes tratadas com doxorrubicina lipossomal (“tratadas com DL”) e outro de pacientes tratadas com outras quimioterapias (“não tratadas com DL”). O padrão de marcação LRP1B observado era maioritariamente citoplasmático e, em alguns casos, membranar. Uma análise semi-quantitativa dos casos permitiu fazer uma avaliar relativamente à intensidade da marcação de LRP1B (ausente, fraca, moderada e forte) e à percentagem de células tumorais marcadas positivamente (< 5%; 5-25%; 25-50%, 50-75% e > 75%). Não houve diferenças significativas na expressão do LRP1B entre os casos e os controlos. Por último, foi analisada a resposta de uma linha de carcinoma de ovário com sobre-expressão de LRP1B à doxorrubicina lipossomal, tendo-se verificado uma tendência de aumento da sensibilidade a este fármaco, quando comparada com as células transfectadas com o vetor vazio. O presente trabalho não só permitiu adquirir competências no estudo da resposta de células a fármacos, como também no estudo da análise de proteínas em linhas celulares e em tecidos. Os resultados obtidos serão importantes para avaliar a relevância da expressão de LRP1B na resposta à terapia lipossomal de pacientes com carcinoma de ovário em tratamento.

LRP1B (Low-density lipoprotein receptor-related protein 1B), belonging to the low-density lipoprotein receptor superfamily, interacts with various ligands and acts as a mediator of endocytosis. Its gene is described as one of the 10 most deleted in cancers. Although LRP1B´s role in cancer has not been fully explored, its endocytic activity may play an important role in modulating the presence of tumor microenvironment factors. It may also affect drug internalization and contribute to resistance towards liposomal therapies, namely to liposomal doxorubicin in ovarian cancer. Most studies that focus on the dysfunction of LRP1B are based on DNA/RNA analysis. Although there are some studies reporting the use of antibodies for the detection of LRP1B protein, information is still scarce, probably due to limitations on the antibodies used and to the fact that LRP1B is a high molecular weight protein, encoded by a long cDNA difficult to clone. In the recent years, new antibodies to LRP1B have appeared which may allow to better characterize the function of this protein in cancer. Therefore, this project aimed to analyze the expression and localization of LRP1B in ovarian carcinoma with commercially available antibodies, using Western blot and immunohistochemistry (IHC) methodologies. This work also aimed at the acquisition of competencies in cell culture of human tumor cell lines and in drug response analysis methodologies, using LRP1B-overexpressing ovarian carcinoma cell lines as a model. Although it was not possible to evaluate LRP1B expression in ovarian tumor cell lines using Western blot (due to the lack of specificity of the antibodies used under the conditions tested) the results obtained with the IHC methodology were very positive. In fact, it was possible not only to optimize antibodies but also to use them to analyze LRP1B expression in ovarian cancer. A series of samples of ovarian carcinomas obtained from patients treated with chemotherapy comprising two groups were analyzed: patients treated with liposomal doxorubicin (“treated with DL”) and controls treated with other chemotherapies (“non-treated with DL”). LRP1B staining pattern was mostly cytoplasmic and, in some cases, membranous. A semi-quantitative analysis of the cases allowed their evaluation in terms of intensity of LRP1B staining (absent, weak, moderate and strong) and also of the percentage of positively stained tumor cells (< 5%; 5-25%; 25-50%; 50-75% and > 75%). There were no significant differences in LRP1B expression between “treated with DL” and “not treated with DL”. Finally, the response to liposomal doxorubicin of an LRP1B-overexpressing ovarian carcinoma line was analyzed, and a tendency to increased sensitivity to this drug was observed, when comparing to cells transfected with the empty vector. The present work allowed not only to acquire competencies in the study of cell response to drugs, but also in the study of protein analysis in cell lines and tissues. The results obtained will be important to evaluate the relevance of LRP1B expression in the response of patients undergoing ovarian carcinoma treatment to liposomal therapy.