From genes to population: effects of toxicants on Enchytraeus albidus

Abstract

Nowadays, a systems biology approach is both a challenge as well as believed to be the ideal form of understanding the organisms’ mechanisms of response. Responses at different levels of biological organization should be integrated to better understand the mechanisms, and hence predict the effects of stress agents, usable in broader contexts. The main aim of this thesis was to evaluate the underlying mechanisms of Enchytraeus albidus responses to chemical stressors. Therefore, there was a large investment on the gene library enrichment for this species, as explained ahead. Overall, effects of chemicals from two different groups (metals and pesticides) were assessed at different levels of biological organization: from genes and biochemical biomarkers to population endpoints. Selected chemicals were: 1) the metals cadmium and zinc; 2) the insecticide dimethoate, the herbicide atrazine and the fungicide carbendazim. At the gene and sub-cellular level, the effects of time and dosage were also adressed. Traditional ecotoxicological tests - survival, reproduction and avoidance behavior - indicated that pesticides were more toxic than metals. Avoidance behaviour is extremely important from an ecological point of view, but not recommended to use for risk assessment purposes. The oxidative stress related experiment showed that metals induced significant effects on several antioxidant enzyme activities and substrate levels, as well as oxidative damage on the membrane cells. To increase the potential of our molecular tool to assess transcriptional responses, the existing cDNA library was enriched with metal and pesticide responding genes, using Suppression Subtractive Hybridization (SSH). With the sequencing information obtained, an improved Agilent custom oligonucleotide microarray was developed and an EST database, including all existing molecular data on E. albidus, was made publicly available as an interactive tool to access information. With this microarray tool, most interesting and novel information on the mechanisms of chemical toxicity was obtained, with the identification of common and specific key pathways affected by each compound. The obtained results allowed the identification of mechanisms of action for the tested compounds in E. albidus, some of which are in line with the ones known for mammals, suggesting across species conserved modes of action and underlining the usefulness of this soil invertebrate as a model species. In general, biochemical and molecular responses were influenced by time of exposure and chemical dosage and these allowed to see the evolution of events. Cellular energy allocation results confirmed the gene expression evidences of an increased energetic expenditure, which can partially explain the decrease on the reproductive output, verified at a later stage. Correlations found throughout this thesis between effects at the different levels of biological organization have further improved our knowledge on the toxicity of metals and pesticides in this species.

Actualmente, em ecotoxicologia, uma abordagem ao nível da biologia de sistemas representa não só um desafio, como se acredita ser a forma ideal para a compreensão dos mecanismos de resposta dos organismos. A integração de respostas de diferentes níveis de organização biológica, permite a melhor percepção dos mecanismos envolvidos, e assim possibilita a previsão de efeitos de agentes tóxicos num contexto alargado. O objectivo principal desta tese foi a avaliação dos mecanismos de resposta de Enchytraeus albidus a stressores químicos. Desta forma, um grande investimento foi feito de forma a enriquecer a biblioteca genómica desta espécie, como explicado mais adiante. Em suma, os efeitos de compostos químicos pertencentes a duas classes diferentes (metais e pesticidas) foram avaliados a níveis de organização biológica distintos: desde parâmetros populacionais até bioquímicos e moleculares com a alteração de expressão genética. Os compostos seleccionados foram: 1) os metais cádmio e zinco; 2) o insecticida dimetoato, herbicida atrazina e fungicida carbendazim. Ao nível sub-cellular e genético, os efeitos do tempo de exposição e da dose aplicada também foram avaliados. Os testes de ecotoxicologia tradicionais – sobrevivência, reprodução e evitamento – mostraram uma maior toxicidade dos pesticidas em relação aos metais. O evitamento é um parâmetro de extrema importância do ponto de vista ecológico, apesar de não recomendado para avaliação de risco. O estudo dos indicadores de stress oxidativo revelou que o Zn e o Cd induziram efeitos significativos na actividade de várias enzimas antioxidantes e níveis de substratos, provocando igualmente danos oxidativos nas membranas celulares. De forma a aumentar as potencialidades da nossa ferramenta molecular disponível para avaliar respostas ao nível da transcrição, a biblioteca de cDNA existente foi enriquecida com genes de resposta a metais e a pesticidas, usando o método de SSH. A partir das sequências obtidas foi desenvolvido um microarray de oligonucleótidos (Agilent), assim como uma base de dados de utilização gratuita na internet que reúne todos os dados moleculares disponíveis para E. albidus e constitui uma ferramenta interactiva de acesso a informação. Com a aplicação do novo microarray, foram obtidos dados novos e relevantes acerca dos mecanismos de toxicidade, tendo sido possível a identificação de diferentes vias metabólicas afectadas por cada composto químico. Os resultados obtidos permitiram a identificação de mecanismos de acção destes compostos em E.albidus que, em grande parte, coincidem com mecanismos descritos para mamíferos, sugerindo que os modos de acção são conservados em várias espécies e sublinhando a utilidade deste invertebrado como espécie modelo. De um modo geral, as respostas bioquímicas e moleculares foram influenciadas pelo tempo de exposição e concentração do composto tóxico, permitindo seguir a evolução dos eventos. Os resultados da determinação da alocação energética confirmaram as evidências de um aumento de gastos energéticos, sugeridas pelo microarray, e que podem explicar parcialmente o decréscimo na reprodução verificado numa fase posterior. As correlações encontradas no decorrer desta tese entre parâmetros de vários níveis de organização biológica, contribuíram para uma melhor compreensão da toxicidade de metais e pesticidas nesta espécie.