Influencia del consumo de ácidos grasos sobre la expresión génica en pollo de carne determinado por microarray

Abstract

El objetivo general de este trabajo de Tesis Doctoral es evaluar los efectos de dietas ricas en diferentes tipos de ácidos grasos (saturados, poli-insaturados omega 6 y omega 3) sobre el transcriptoma de grasa abdominal, hígado y músculo esquelético en pollos de engorde mediante el uso de GeneChip microarrays. En concreto se investiga que genes y vías metabólicas, de las conocidas hasta el momento, se ven afectadas en el pollo de carne al ingerir raciones con distinto grado de insaturación y se comprueba si los cambios en la expresión de determinados genes y vías metabólicas, descritos en experimentos previos, también se observan mediante el uso de GeneChip microarrays. En una segunda fase, se estudia la evolución con la edad del pollo del nivel de expresión de diferentes genes seleccionados a partir de los resultados obtenidos del experimento anterior y de la bibliografía existente en esta área para pollos de carne. Se diseñó un ensayo con pollos de carne alimentados con 4 piensos experimentales, una dieta baja en grasa (0,5% de grasa añadida) y 3 raciones suplementadas con 10% de diferentes grasas: sebo, como fuente de AGS de cadena larga, aceite n-3 (70% aceite de linaza + 30% aceite de pescado) rico en AGPI n-3 y aceite de girasol, rico en AGPI n-6. Dentro de este ensayo se desarrollaron dos estudios en paralelo. Uno para estudiar las variaciones producidas por las dietas experimentales en el transcriptoma de la grasa abdominal, el hígado y el músculo esquelético de pollos de carne de 50 días. Otro para estudiar la evolución en el tiempo de la expresión de genes seleccionados. Para ello se tomaron muestras de estos mismos tejidos (grasa abdominal, hígado y músculo) a lo largo del crecimiento de los pollos, tras 0, 10, 21, 35 y 45 días de administración de los piensos experimentales. Los piensos experimentales se suministraron a los animales desde el día 14 de vida. Cambios fenotípicos. Los rendimientos productivos de los animales se registraron como una comprobación previa de que se producían los cambios fenotípicos esperados. Así, efectivamente, los animales alimentados con la dieta rica en ácidos grasos omega-3 presentaron un menor depósito de grasa abdominal comparados con aquellos alimentados con dietas ricas en ácidos grasos saturados. Los cambios en la composición de los diferentes tejidos también fueron los esperados con composiciones que reflejaban los perfiles de ácidos grasos de las dietas. Los animales alimentados con dietas bajas en grasa, y con menor contenido en energía, tal y como se había comprobado en experimentos previos, presentaron rendimientos completamente diferentes al resto de grupos. Estudio del transcriptoma. La dieta rica en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 fue la que indujo mayores cambios en los transcriptomas estudiados, sobretodo en el caso de grasa abdominal y músculo esquelético. En el caso de la grasa abdominal la dieta rica en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 produjo cambios respecto a todas las otras dietas y, sobre todo, con variaciones en vías metabólicas poco específicas o relacionadas con la metabolización de diferentes moléculas. En el caso del músculo las diferencias de expresión se encontraron fundamentalmente entre la dieta rica en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 en comparación con la dieta rica en ácidos grasos saturados, y la mayoría de las vías afectadas estaban relacionadas con el sistema inmune. Estudio de genes seleccionados. En este estudio se seleccionaron genes de interés según los resultados obtenidos en el estudio del transcriptoma y la bibliografía disponible. No todos los genes seleccionados mostraron cambios en respuesta a las diferentes dietas o al tiempo de consumo de estas. Los genes ITGB2, FABP7, LIPA, GSTA3, LITAF mostraron diferencias en su expresión en grasa abdominal entre los pollos alimentados con la dieta rica en ácidos grasos insaturados omega-3 y los alimentados con omega-6 o saturados. El gen CYP2C18 mostró mayores niveles de expresión en hígado en animales alimentados dietas ricas en ácidos grasos poli-insaturados n-3 y n-6 en comparación con aquellos alimentados con saturados. Los genes CLU y ITGB2 en grasa abdominal, CYP2C18, PCK1, PPARa, PPARg y FASN en hígado y ITGB2 y FABP4 en músculo mostraron cambios en su expresión con la edad del animal. De estos estudios podemos concluir que el transcriptoma de la grasa abdominal es mucho más sensible a cambios en la composición de la grasa de la dieta que el transcriptoma del hígado o del músculo esquelético. Además, dietas ricas en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 producen transcriptomas muy diferentes a aquellos producidos por dietas ricas en ácidos grasos omega-6, saturados o incluso por dietas bajas en grasa en la grasa abdominal y el músculo esquelético. Los genes que presentaron cambios debido a las dietas o a la edad identificados en el presente trabajo, están principalmente relacionados con la metabolización de lípidos y otras moléculas y con la respuesta inmune, y son de interés para futuros estudios en pollos de engorde relacionados con el metabolismo lipídico o el desarrollo de los animales.

The general aim of this PhD thesis is to assess the effects that diets rich in different fatty acid families (saturated, poly-unsaturated omega-6, or omega-3) have on the transcriptome of adipose tissue, liver, and skeletical muscle in broiler chickens, using GeneChip microarrays. In particular, this work wants to describe differences in gene/pathway expression in broiler chickens fed diets differing in their unsaturation degree, and want to verify those differences in genes/pathways expression previously described in literature. In a second part of this PhD Thesis, we describe the time-evolution of the expression of genes selected from those found important in the microarray data and in literature on broiler chickens. In this work, broiler chickens were fed 4 different experimental diets, a low-fat diet (0.5% added fat) and 3 diets supplemented with 10% of three different fats: tallow, rich in saturated fatty acids, a mixture of n3 oils (70% linseed oil + 30% fih oil) rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids, and sunflower oil rich in poly-unsaturated omega-6 fatty acids. This work includes two experiments that were developed parallel in time. First experiment studies the effects of the experimental diets on transcriptomes of abdominal fat, liver, and skeletical muscle in 50 days old broiler chicken; second experiment describes time-evolution of the expression of selected genes depending on the diets. Abdominal fat, liver, and skeletical muscle were sampled in broiler chickens on days 0, 10, 21, 35, and 45 after experimental feeds were introduced to the animals on day 14 of age. Phenotype changes. Productive performance was registered as a pre-requisite before we could proceed to run microarray analysis. Chickens fed the diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids showed lower deposition of abdominal compared to those fed the diet rich in saturated fatty acids. The different studied tissues also showed the expected changes in composition mimicking fatty acid profile of the respective diets. Broiler chickens fed low fat diet, and so with lower energy levels, showed productive performance records completely different to all other treatments, as expected. Study of transcriptome. Diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids induced most of the important observed changes in expression, especially in abdominal fat and skeletical muscle. For abdominal fat, diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids induced changes compared to all other diets, affecting several unspecific pathways related to metabolism of different molecules. For skeletical muscle, differential expression was mainly found between the diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids and diet rich in saturated fatty acids. Most of the pathways affected in this case were related to immune response. Study of selected genes. A group of genes were selected based on results obtained from the microarray experiment and previous results available on literature. Not all selected genes were differentially expressed among diets or time points. Genes ITGB2, FABP7, LIPA, GSTA3, LITAF showed differences on expression in abdominal fat of broiler chickens fed the diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids compared to those fed diets rich in poly-unsaturated omega-6 or saturated fatty acids. Gene CYP2C18 showed increased expression levels in liver of broiler chickens fed diets rich in poly-unsaturated omega-3 or omega-6 fatty acids compared to those fed saturated fatty acids. Genes CLU and ITGB2, in abdominal fat, genes CYP2C18, PCK1, PPARa, PPARg and FASN in liver and genes ITGB2 and FABP4 in skeletical muscle were affected by the age of the broiler chicken. As conclusions, we can say the transcriptome of the adipose tissue is more sensible to changes in the composition of the fat included in the diet than liver or muscle transcriptomes. Moreover, diets rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids resulted in very different transcriptomes when compared to diets rich in saturated or poly-unsaturated omega-6 fatty acids, or even when compared to low fat diet. Genes differencialy expressed among diets or sampling days were mainly related to metabolism of different molecules and to immune response. These are genes of interest for future studies related to lipid metabolism or development in broiler chickens.