Chromatin-bound DYRK1A : promoter occupancy and implications in the regulation of ribosomal protein gene expression

Abstract

DYRK1A (dual-specificity tyrosine-regulated kinase 1A) belongs to a conserved family of protein kinases present in all eukaryotes. DYRK1A is known to participate in cell proliferation and differentiation decisions and to fulfill key roles in brain development. Data from our laboratory indicate that DYRK1A acts as a transcriptional activator directly at proximal promoter regions of genes containing a conserved palindromic motif. In this Thesis work, the mechanism of DYRK1A recruitment to chromatin has been explored, as well as the DYRK1A transcriptional effect on a subset of gene targets, namely ribosomal protein genes (RPGs). By using electrophoretic mobility assays, DYRK1A has been found to interact directly with single-stranded DNA probes containing the consensus motif in vitro. Analysis of ChIP-Seq (chromatin immunoprecipitation coupled with high-throughput sequencing) data from ENCODE revealed that several transcription/chromatin-related factors are recruited to the DYRK1A-consensus motif. The list includes the co-repressor ZBTB33/KAISO and the tumor suppressor BRCA1. By means of genome-wide ChIP-Seq approaches, the presence of the two proteins has been established in DYRK1A-bound promoter regions enriched in the conserved motif; in fact, DYRK1A seems to be involved in BRCA1 recruitment to its genomic loci, probably in a catalytic-dependent manner since BRCA1 has shown to be a DYRK1A substrate. In addition, the analysis shows that the presence of DYRK1A at RPG promoters negatively correlated with that of the transcription factor GABP, suggesting the existence of two clusters of RPGs from the viewpoint of their transcriptional regulation. Indeed, the mRNA levels of chromatin-bound DYRK1A RPGs were significantly reduced in DYRK1A-silenced cells, which also showed an impairment in protein synthesis. Based on these results, DYRK1A might be a novel modulator of cell growth by regulating the expression of RPGs.

DYRK1A (dual-specificity tyrosine-regulated kinase 1A) pertenece a una familia de proteína quinasas presente en todos los organismos eucariotas. DYRK1A participa en procesos de proliferación y diferenciación celular, y desempeña funciones clave durante el desarrollo del cerebro. Datos obtenidos en nuestro laboratorio indican que DYRK1A actúa como un activador transcripcional directamente a nivel de regiones promotoras de genes que mayoritariamente contienen una secuencia palindrómica conservada. En esta Tesis se han estudiado posibles mecanismos de reclutamiento de DYRK1A a cromatina, así como el efecto transcripcional de DYRK1A sobre un grupo de sus genes diana, en particular aquellos que codifican para proteínas ribosomales (GPRs). Mediante ensayos de cambio de movilidad electroforética, se ha demostrado que DYRK1A puede interaccionar in vitro directamente con sondas de ADN de hebra simple que contienen el motivo consenso. El análisis de datos de ChIP-Seq (inmunoprecipitación de cromatina asociada a secuenciación masiva) procedentes de ENCODE reveló que algunos factores relacionados con procesos de transcripción y regulación de la cromatina podrían ser reclutados al motivo asociado a DYRK1A. La lista incluye al co-represor ZBTB33/KAISO y al supresor de tumores BRCA1. Mediante estudios globales de ChIP-Seq se ha establecido el patrón de reclutamiento de las tres proteínas en la línea celular T98G, demostrando su presencia común en regiones promotoras enriquecidas en el motivo palindrómico. DYRK1A está involucrado en el reclutamiento de BRCA1 a sus correspondientes regiones genómicas, probablemente dependiendo de la actividad catalítica de la quinasa ya que los resultados indican que BRCA1 es un sustrato de DYRK1A. Adicionalmente, el análisis muestra que la presencia de DYRK1A en GPRs correlaciona negativamente con la del factor de transcripción GABP, sugiriendo la existencia de dos grupos de GPRs desde el punto de vista de regulación transcriptional. De hecho, los niveles de RNA mensajero de GPRs dianas de DYRK1A están significativamente reducidos en células donde la expresión de DYRK1A está silenciada; estas células también presentan una reducción de la síntesis proteica. Todos estos datos permiten proponer a DYRK1A como un nuevo regulador de la transcripción de GPRs, contribuyendo así al control del crecimiento celular.