| Abstract: | Human tuberculosis (TB), caused by an infectious agent, Mycobacterium tuberculosis, represents a global threat leading the causes of death in adults, responsible for killing approximately 2 million of people a year throughout the world. It is estimated that one third of the population is latently infected with the bacillus. India, China, Indonesia, South African, and Nigeria are the first five countries in the raking of the greatest absolute numbers of cases and Brazil is in the 15th position. The M. tuberculosis can remain viable in the infected host cell for a long time. This condition is called latent TB, which is the non-contagious form of the disease when the bacteria persists inactive. More efficient and less toxic chemotherapy agents are needed to reduce the duration of current treatments, as well as to improve the possibilities of treatment for MDR-TB and XDR-TB strains. Moreover, two major approaches in combating this disease are a more effective treatment to latent TB, urgent to prevent the disease developing to the active form, and drugs that do not interfere with the anti-retroviral therapy used for AIDS. Enzymes involved in purine salvage pathway are of special interest to this effort. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT; EC 2. 4. 2. 8) is a purine salvage enzyme that catalyzes the Mg+2-dependent reversible transfer of the 5’-phosphoribosyl group from α-D-ribofuranose 1’- pyrophosphate 5’-phosphate (also known as 5’-phosphorybosil-α-1’-pyrophosphate; PRPP) to a purine basis (guanine, hypoxanthine) to form the corresponding ribonucleotides IMP (inosine 5`-monophosphate), and GMP (guanosine 5`- monophosphate) with the release of PPi (inorganic pyrophosphate).In this work, we have reported the cloning, expression in E. coli BL21(DE3) cells, purification for the homogeneity, N-terminal sequencing, mass espectrometry analysis, and determination of apparent steady-state kinetic parameters of HGPRT enzyme.
A tuberculose humana (TB), causada por um único agente infeccioso, Mycobacterium tuberculosis, representa uma ameaça global liderando a morte em adultos, responsável por cerca de dois milhões de óbitos por ano no mundo. Estima-se que aproximadamente um terço da população está latentemente infectada com o bacilo. A Índia, China, Indonésia, África do Sul e Nigéria são os primeiros cinco países do ranking com maiores números absolutos de casos e o Brasil encontra-se na 15ª posição. O M. tuberculosis pode permanecer viável dentro da célula do hospedeiro infectado por longo tempo. Esta condição é chamada de TB latente, que é a forma não contagiosa da doença, onde a bactéria permanece inativa. Agentes quimioterápicos mais eficazes e menos tóxicos são necessários para reduzir a duração do tratamento atual, assim como melhorar as possibilidades de tratamento para as cepas MDR-TB e XDR-TB. Além disso, há necessidade de um tratamento eficaz para a TB latente, impedindo que a doença se desenvolva para a forma ativa e, também, drogas que não interfiram com os anti-retrovirais, utilizados para o tratamento da AIDS. Neste contexto, enzimas envolvidas no salvamento de purinas são de interesse particular. A hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT – EC 2. 4. 2. 8) é uma enzima chave da via de salvamento de purinas que catalisa a transferência reversível, dependente de magnésio, de um grupo fosforibosil do 5- fosfo-α-D-ribosil-pirofosfato (PRPP) para uma base purina (hipoxantina ou guanina) para formar o ribonucleotídeo purina, inosina monofosfato ou guanosina monofosfato, liberando pirofosfato (PPi). Neste trabalho, relatamos a clonagem, a expressão em células E. coli BL21(DE3), a purificação para homogeneidade, o sequenciamento N-terminal, a análise da espectrometria de massas e a determinação dos parâmetros cinéticos aparentes da enzima HGPRT. |
