Immunodétection de l'ATP diphosphohydrolase dans les cellules eucaryotiques
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Publication date
1986Author(s)
Vachereau, André
Subject
PhosphatasesAbstract
L'ATP diphosphohydrolase (ou apyrase) est un enzyme qui catalyse l'hydrolyse des groupements y et B phosphates des diphospho et triphosphonucléosides. Lorsque ADP ou ATP est utilisé comme substrats, les produits de ces réactions enzymatiques sont de l'AMP et une ou deux moles de phosphates inorganiques (Pi). L'existence de ce type d'hydrolase avait été précédemment rapporté suite à des observations biochimiques chez quelques types de cellules eucaryotiques; ce n'est toutefois que récemment que l'enzyme fut clairement identifié chez un mammifère, en l'occurence dans une fraction particulaire du pancréas du porc. L'ATP diphosphohydrolase pancréatique a par la suite été purifiée à un haut niveau et comprend deux protéines principales d'un poids moléculaire d'environ de 58 et 28 kDa ainsi qu'une composante mineure de 46 kDa. Même si l'enzyme est présumément l'une des deux bandes majeures de la fraction purifiée, la protéine responsable de l'activité enzymatique n'avait pas été clairement identifiée. Au cours du présent travail, nous avons développé une nouvelle méthode pour purifier l'ATP diphosphohydrolase à partir de la membrane du grain de zymogènes du pancréas du porc. Ainsi par l'utilisation de techniques successives de dialyse en présence d'ADP et de B-mercaptoéthanol, de traitement à la saponine et d'électrophorèse sur gel d'acrylamide dans des conditions nondénaturantes, nous avons localisé sur gel l'activité enzymatique qui correspondait à l'ATP diphosphohydrolase. Le sous-fractionnement de cette préparation active par électrophorèse sur gel d'acrylamide-SDS a permis d'obtenir trois polypeptides de poids moléculaire de 50, 4G et 29 kDa. Au cours d'une deuxième étape, nous avons produit des anticorps polyclonaux contre chacun de ces polypeptides. Nous avons ensuite vérifié l'irnmunoréactivité des immunséra contre une série d'organes du rat par une technique d'immunobuvardage. Les antiséra des polypeptides 50 et 29 kDa ont produit une réaction positive avec un polypeptide de 58 kDa dans tous les cas sauf pour les globules rouges de l'humain et du rat. De plus une immunoréactivité à 50 kDa a été détectée lorsque nous avons utilisé les préparations suivantes: sécrétions oviductales du poulet, glandes salivaires de l'insecte Rhodnius prolixus et levures Saccharomyces cerevisiae. Nous avons aussi observé une réaction positive à 50 kDa avec du pancréas humain adulte et foetal (15 semaines) ainsi que dans la tumeur pancréatique de Longnecker. Finalement, le même type d'hydrolase a été identifiée par immunobuvardage et par dosages biochimiques dans la sécrétion microvésiculaire pancréatique et dans le sérum du rat. Au cours d'un travail effectué en collaboration avec l'équipe du Dr Rosenberg de l'Université du Minnesota, nous avons caractérisé davantage l'enzyme d'origine oviductale, purifié sur colonne d'affinité à lectines; ainsi grâce à des anticorps dirigés contre l'ATP diphosphohydrolase pancréatique et de diverses techniques d'électrophorèse nous avons purifié l'enzyme oviductal à un très haut niveau. Toutes ces observations suggèrent que l'unité catalytique de l’ATP diphosphohydrolase est un polypeptide de 58 kDa. Le ou les rôles de cet enzyme demeurent toutefois inconnus mais puisque cet enzyme se retrouve aussi bien chez la levure que chez l'humain, c'est selon toute vraisemblance une protéine bien conservée du point de vue évolution. Ceci nous permet donc de considérer que l'enzyme jouerait un rôle très important dans le fonctionnement cellulaire.
Collection
- Sciences – Thèses [805]