Evaluation of antimicrobial strategies against biomaterial-associated infections: impact of the surrounding environmental conditions

Abstract

Bacterial colonisation of biomedical devices frequently leads to biofilm formation on its surface, originating biomaterial-associated infections (BAI). Antibiotherapy is the most common BAI treatment, however with development of antibiotic resistance, antimicrobial peptides (AMP) are emerging as potential alternatives. However, salinity, an intrinsic condition of the human body, may impair AMP action. Moreover, the hypoxic conditions characteristic of BAI can modulate the establishment and control of the infection. Thus, the main goals of this work were to understand how different oxygen and salt concentrations can affect single and polymicrobial biofilm establishment and the efficiency of the AMP colistin in a prophylactic approach. The microbial composition of the mixed biofilms and the potential development of resistance phenomena were also assessed. The experimental work was conducted using Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis and Pseudomonas aeruginosa as models of infection, testing different NaCl and oxygen conditions. Colistin minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations against single and polymicrobial planktonic cultures were determined. Biofilm formation and susceptibility to colistin was also evaluated through the determination of biomass production and biofilm-cells viability. Relative distributions of microorganisms within polymicrobial biofilms were assessed and colony morphology was observed. A population analysis profile was conducted in planktonic and biofilm cultures of K. pneumoniae in order to access the occurrence of heteroresistance. Sodium chloride seemed to impair colistin action in P. aeruginosa planktonic cultures. In biofilms, it seemed to promote biomass production namely in P. aeruginosa, however the effect of NaCl on colistin action was highly dependent on the microorganism. Prevalence of P. aeruginosa in polymicrobial biofilms was significantly reduced in the presence of NaCl. In general, oxygen deficiency impaired P. aeruginosa biofilm formation and the antibacterial action of colistin both in planktonic and biofilm lifestyles, which was more notorious in presence of NaCl. K. pneumoniae revealed to possess a sub-population resistant to colistin exclusively associated with biofilms and characterized by small colony morphologies. In conclusion, colistin appeared to be an antimicrobial with a questionable efficacy in the treatment of BAI. It was not possible to establish a relationship between the presence of NaCl and the action of colistin, however NaCl seemed to modulate P. aeruginosa biofilm formation exerting a bactericidal effect or by interfering with its motility. In hypoxic conditions, colistin action is impaired and biofilm formation is significantly lower. K. pneumoniae was found to be a strain heteroresistant to colistin and this phenomenon seemed to be closely linked to biofilm formation. To our knowledge this is the first report linking heteroresistance to biofilm formation and to a morphological distinct sub-population.

A colonização bacteriana de dispositivos biomédicos conduz frequentemente à formação de biofilmes na sua superfície originando as infecções associadas aos biomateriais (IAB). A antibioterapia é o tratamento mais comum, no entanto, com o desenvolvimento da resistência aos antibióticos, os péptidos antimicrobianos (PAM) estão a emergir como potenciais alternativas. No entanto, a salinidade, uma condição intrínseca do corpo humano, pode prejudicar a acção dos PAM. Além disso, a hipoxia, característica das IAB, pode modular o estabelecimento e o controlo da infecção. Os principais objectivos deste trabalho foram compreender como diferentes concentrações de oxigénio e sal podem afectar a formação de biofilmes simples e mistos, e a eficiência do PAM colistina, numa abordagem profiláctica. A composição microbiana dos biofilmes mistos e o potencial desenvolvimento de fenómenos de resistência foram também estudados. O trabalho experimental foi realizado utilizando Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, e Pseudomonas aeruginosa como modelos de infecção testando diferentes condições de NaCl e de oxigénio. A concentração mínima inibitória e bactericida da colistina em culturas planctónicas simples e mistas foi determinada. A formação de biofilme e a sua susceptibilidade à colistina foi também avaliada recorrendo à determinação da produção de biomassa e da análise da viabilidade celular do biofilme. As distribuições relativas de microorganismos dentro de biofilmes mistos foram determinadas e a morfologia das colónias foi observada. Uma análise ao perfil populacional (APP) foi realizada em culturas planctónicas e de biofilme de K. pneumoniae de modo a detectar a ocorrência de heterorresistencia. O NaCl pareceu prejudicar a acção da colistina nas culturas planctónicas de P. aeruginosa. Em biofilmes, pareceu promover a acumulação de biomassa nomeadamente em P. aeruginosa, no entanto o efeito do NaCl sobre a acção da colistina foi altamente dependente do microrganismo. A prevalência de P. aeruginosa em biofilmes mistos foi significativamente reduzida em presença de NaCl. No geral, a deficiência de oxigénio inibiu a formação de biofilme em P. aeruginosa e a acção antibacteriana da colistina tanto nos ensaios planctónicos como nos de biofilme, o que foi potenciado na presença de NaCl. K. pneumoniae revelou possuir uma sub-população resistente à colistina exclusivamente associada a biofilmes e caracterizada por morfologias de colónia pequena. Em conclusão, a colistina parece ser um agente antimicrobiano com uma eficácia discutível no tratamento de IAB. Não foi possível estabelecer uma relação entre a presença de NaCl e a acção da colistina, no entanto, o NaCl parece modular a formação de biofilmes em P. aeruginosa, exercendo um efeito bactericida ou por interferir com a sua motilidade. Em condições de hipoxia, a acção da colistina é prejudicada e a formação e biofilme é significativamente menor. K. pneumoniae revelou-se uma estirpe heterorresistente à colistina e este fenómeno parece estar intimamente ligado à formação de biofilme. Ao nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a associar a heterorresistencia à formação de biofilme e a uma sub-população morfologicamente distinta.