Evolutionary engineering of lactic acid bacteria

Abstract

Biotechnology plays an essential role in the modern industry and in guaranteeing sustainable future for humankind. Advances of metabolic engineering and systems biology allow the adaption of complex cellular networks for the production or uptake of certain molecules, with great economical interest, enabling the creation of cell factories. Among the potential microorganisms that fit this role is the well-known group, due to their role in food fermentation and, in particular, their use in dairy industry, known as Lactic acid bacteria (LAB). Their metabolism is known for its relative simplicity and lack of biosynthesis capacity, creating a potential application as a cell factory in transformation processes. The purpose of this work is to develop through evolutionary engineering a strain of LAB capable of utilizing mannitol as the sole carbon source and identify mutations in the evolved strain, with the objective of associate these mutations with the mannitol consuming phenotype. Through the usage of adaptive laboratory evolution (ALE), several strains of LAB were evolved and a selected evolved strain of Lactococcus lactis subsp cremoris, capable of consuming mannitol as the sole carbon source successfully, was sequenced using next-generation sequencing. From the analysis of this genomic data using several bioinformatics tools available, 3 mutations affecting the genes pta, adhA and mtlF were identified as likely having an impact in the new phenotype presented by the evolved strain. This work provides an initial inquiry into a potential application of brown algae, which accumulate mannitol, as a new feedstock for biofuel production using LAB as cell factories.

A Biotecnologia tem assumido um papel preponderante nos processos industriais da atualidade, tendo em vista a conjugação destes com a questão da sustentabilidade da espécie humana. Os avanços na engenharia metabólica e na biologia de sistemas tem permitido a adaptação das complexas redes celulares, com o intuito de produzir ou consumir certos compostos, de forma a aumentar o seu valor económico, criando ‘fábricas celulares’. Entre os potenciais organismos para este tipo de aplicação encontra-se um grupo bastante conhecido devido à sua função na fermentação de certos alimentos, especialmente lacticínios, denominadas bactérias ácido-lácticas. Estas possuem um metabolismo relativamente simples e não apresentam várias capacidades biossintécticas, tornando-as em potenciais candidatas a serem usadas como ‘fábricas celulares’ em processos de transformação. Neste trabalho pretende-se adaptar através de engenharia evolutiva várias espécies de bactérias ácido-lácticas à utilização de manitol como fonte de carbono e proceder à identificação de mutações no genoma das estirpes evoluídas através de tecnologias de sequenciação de ADN, com o propósito de relacionar estas mutações com o fenótipo capaz de consumir manitol. Com recurso à engenharia evolutiva, várias estirpes de bactérias ácido-lácticas foram evoluídas e uma dessas estirpes, Lactococcus lactis subsp cremoris, capaz de consumir manitol como a única fonte de carbono, foi selecionada para ser sequenciada com recurso tecnologias de sequenciação de ADN. Através da análise destes dados genómicos usando várias ferramentas bioinformáticas, foi possível determinar 3 mutações que afectam os genes pta, adhA e mtlF que possivelmente estarão relacionadas com o fenótipo exibido pelas espécies evoluídas. Este trabalho serve como uma avaliação ao potencial da utilização de algas castanhas, que acumulam manitol, como um novo recurso para a produção de biocombustíveis, usando bactérias ácido-lácticas como ‘fábricas celulares’ para a sua transformação.