Production of curcumin from ferulic acid by an engineered Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Curcumin is a secondary metabolite produced by Curcuma longa. Studies have confirmed its biological and therapeutic effects in several diseases being the anticancer activity the most documented. Since curcumin is synthetized in low amounts, its heterologous production could represent a rapid and easy method to obtain large amounts of this bioactive compound. Curcumin has already been produced by Escherichia coli. However, the curcumin biosynthetic pathway has never been engineered in Saccharomyces cerevisiae. As a eukaryotic organism, it presents unique advantages over E. coli regarding the expression of plant derived genes. This work aimed to design, construct and validate a biosynthetic pathway composed by genes from different plants to produce curcumin from ferulic acid in an engineered S. cerevisiae. The enzymes involved in the artificial pathway are: 4-coumarate-CoA ligase (4CL) and different type III polyketide synthases (PKSs). In C. longa there are two types of PKSs - diketide-CoA synthase (DCS) and curcumin synthase (CURS) - that catalyse different reactions. Curcuminoid synthase (CUS) from Oryza sativa is also a PKS and catalysis the “one-pot” synthesis of curcuminoids in E. coli. Shuttle vectors with enzymes from different organisms were constructed and transformed into two S. cerevisiae strains. The vectors carried 4CL from Arabidopsis thaliana or Lithospermum erythrorhizon, and CUS or DCS and CURS. Curcumin was visually produced with a pathway composed by 4CL from L. erythrorhizon and CUS from O. sativa. The maximal curcumin production was 233.42 ng/L representing a yield of 1.46 %. Also, three different extraction methods were tested which revealed the importance of cell lysis in curcumin extraction from yeast. In addition, CRISPR-Cas9 method was used to knockout a gene from S. cerevisiae that codifies ferulic acid decarboxylase. As expected, the mutant strain was not able to consume ferulic acid. However, no curcumin production could be detected in the preliminary assays. It is important to mention that this study allowed to produce curcumin for the first time in an engineering yeast. In the future, optimizations at genetic and operational level are needed to improve the curcumin titters.

A curcumina é um metabolito secundário produzido pela Curcuma longa. Vários estudos confirmaram o seu efeito biológico e terapêutico em várias doenças sendo a atividade anticancerígena a mais documentada. Devido ao facto da curcumina ser sintetizada em pequenas quantidades, a sua produção heteróloga pode representar um método rápido e fácil para obter grandes quantidades deste composto bioativo. A curcumina já foi produzida em Escherichia coli. No entanto, a sua via biossintética nunca foi introduzida em Saccharomyces cerevisiae. Como organismo eucariótico, este apresenta vantagens únicas em relação a E. coli para expressão de genes derivados de plantas. Este trabalho teve como objetivo projetar, construir e validar uma via biossintética composta por genes de diferentes plantas para produzir curcumina a partir de ácido ferúlico em S. cerevisiae. As enzimas envolvidas na via artificial são: 4-cumárico-CoA ligase (4CL) e as policetídeo sintase tipo III (PKS). Em C. longa existem dois tipos de PKSs - diketide-CoA sintase (DCS) e curcumina sintase (CURS) - que catalisam reações diferentes. A curcuminoide sintase (CUS) da Oryza sativa é também uma PKS. Esta enzima foi capaz a sintetizar curcuminoides em E. coli num só passo. Para esse efeito, vetores “shuttle” com enzimas de diferentes organismos foram construídos e transformados em duas estirpes de S. cerevisiae. Os vetores possuíam 4CL de Arabidopsis thaliana ou de Lithospermum erythrorhizon, e CUS ou DCS e CURS. Foi possível aferir visualmente a produção de curcumina nas leveduras onde foi inserida uma via composta por 4CL de L. erythrorhizon e CUS de O. sativa. A produção máxima de curcumina foi de 233,42 ng/L, o que representa um rendimento mássico de 1,5%. Além disso, três métodos de extração diferentes foram testados, o que demostrou a importância da lise celular para extração de curcumina em levedura. Além disso, o método CRISPR-Cas9 foi usado para silenciar um gene em S. cerevisiae que codifica a ácido ferúlico descarboxilase. Como esperado, o mutante resultante não foi capaz de consumir ácido ferúlico. No entanto, em ensaios preliminares também não foi possível detetar a produção de curcumina. É de realçar que este foi o primeiro trabalho em que a curcumina foi produzida por uma levedura geneticamente modificada. No futuro, são necessárias otimizações a nível genético e operacional por forma a aumentar os rendimentos de produção.