Clonagem e caracterização funcional do gene Rad51 de Trypanosoma cruzi

Carlos Gustavo Regis da Silva

Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/1843/BUBD-937G5L

Type:	Dissertação de Mestrado
Title:	Clonagem e caracterização funcional do gene Rad51 de Trypanosoma cruzi
Authors:	Carlos Gustavo Regis da Silva
First Advisor:	Carlos Renato Machado
First Co-advisor:	Santuza Maria Ribeiro Teixeira
First Referee:	Vania Ferreira Prado
Second Referee:	Evanguedes Kalapothakis
Abstract:	O Trypanosoma cruzi é um parasito pertencente à ordem Kinetoplastida e o agente causador da doença de Chagas. Nesse organismo, é observado um baixo grau de divergência entre alelos. Esse fenômeno é pouco comum em organismos de reprodução clonal como o T. cruzi e ocorre devido a rearranjos gênicos como o processo de recombinação. Esse processo também representa uma das vias de reparo de quebras na dupla fita de DNA. O produto do gene Rad51 é uma das principais proteínas envolvidas nesses processos. Essa enzima apresenta a atividade de recombinase, que resulta na trocaentre as fitas de duas moléculas de DNA. Neste trabalho, isolamos e caracterizamos o gene Rad51 de T. cruzi (TcRad51). A análise de ESTs (Expressed Sequence Tags) homólogas ao gene Rad51 de T. brucei permitiu a identificação das regiões C-terminal e N-terminal do produto de TcRad51 e, conseqüentemente, possibilitou a construção de iniciadores específicos para clonagem da janela aberta de leitura desse gene pela técnica da PCR. A seqüência de nucleotídeos foi obtida e utilizada na identificação da seqüência da proteína. Pesquisas em banco de dados revelaram que a proteína TcRad51 tem homologia comRad51 de diversos organismos e também com outras recombinases. Além disso, foram identificados alguns domínios que são necessários para a função de recombinase. A organização de TcRad51, estudada pela técnica de Southern blot, indica que há duas cópias do gene no genoma do T. cruzi. Ensaios de Northern blot mostraram que um único RNA mensageiro é expresso em todas as formas de vida do parasito. O produto desse gene foi capaz de aumentar a taxa de mutação quando expresso em E. coli selvagem, fornecendo evidências de que a proteína TcRad51 interage com DNA bacteriano induzindo uma resposta do sistema S.O.S. Estudos com Saccharomyces cerevisiae nocauteada para o gene ScRad51 mostraram que estas são incapazes de crescer na presença da proteína TcRad51, provavelmente porque esta se liga ao DNA nos locais de quebra da dupla fita no DNA, mascarando-as e impedindo seu reparo. Além dos experimentos voltados para a caracterização desse gene, verificamos também aspectos de evolução molecular em dez cepas de T. cruzi. O que observamos foi um alto grau de conservação de um fragmento de 359 pares de bases do gene TcRad51. A árvore filogenética baseada nesses fragmentos indica que essas cepas se dividem em três grupos. Além disso, duas cepas, 167 e 115, possuem alelos do gene Rad51 que pertencem a dois grupos diferentes indicando que elas são híbridas. Os resultados aqui apresentados abrem uma nova perspectiva para o entendimento da biologia do parasito T. cruzi por identificar um importante gene envolvidono processo de recombinação e reparo de quebra dupla na fita do DNA.
Abstract:	Trypanosoma cruzi is a parasite of the order Kinetoplastida that causesChagas disease. A low level of allele divergence is observed in this organism. Although such high levels of homozygosity are not expected in an organism without sexual reproduction, this phenomenon may be promoted by genetic rearrangements during a recombination process. Recombination is also part of a pathway of double strand breakage repair, and the product of the Rad51 gene is one of the major proteins involved in this process. This enzyme has recombinase activity, whichresults in strand exchange between two DNA molecules. In this work, we have isolated and characterized the Rad51 gene from T. cruzi (TcRad51). A search in the EST database for sequences with homology with T. brucei Rad51 gene allowed us to design a set of primers used to clone the open reading frame for the Rad51 of T. cruzi by PCR. The nucleotide sequence was obtained and used to identify the protein sequence. Sequence comparisons in databases showed that TcRad51 protein hashomology with Rad51 of several organisms and with other recombinases. Also, some domains that are necessary to recombinase function were identified. Southern blot analysis showed that the TcRad51 is presented in two copies in the T. cruzi genome. Northern blot analyses indicated that one messenger RNA is expressed in all forms of the life cycle of this parasite. When expressed in wild type E. coli, the product ofthe TcRad51 gene was able to increase the mutation rate, probably by inducing the S.O.S. response to TcRad51 DNA interaction. Rad51 knockout Saccharomyces cerevisiae was unable to grow in the presence of TcRad51 protein. This phenotype may be caused by the incapacity of this strain to repair double strand breakage, which is masked by TcRad51 protein. In addition to the characterization of the TcRad51 gene, we investigated aspects of molecular evolution in ten strains of T. cruzi. A high degree of conservation was observed in the 5-terminal (359 base pairs fragment) of TcRad51 gene. These strains were divided in three groups according to the phylogenetic analyses based on this fragment. Furthermore, two strains, 167 and 115, may be considered as hybrids because they have alleles that belong to two different groups. The results presented here open new perspectives to the understanding of an important aspect of the T. cruzi biology related to DNA metabolism.
Subject:	Imunologia Bioquímica
language:	Português
Publisher:	Universidade Federal de Minas Gerais
Publisher Initials:	UFMG
Rights:	Acesso Aberto
URI:	http://hdl.handle.net/1843/BUBD-937G5L
Issue Date:	1-Mar-2002
Appears in Collections:	Dissertações de Mestrado

Files in This Item:

File	Description	Size	Format
dissertacao.pdf		1.42 MB	Adobe PDF	View/Open

Show full item record