gamma-Cyclodextrin (gCD) has been recently used as pharmaceutical excipient in topical formulation for ocular delivery. The high corticosteroid concentration in various ocular tissues has been reported after topical application of aqueous eye drops, especially achieving therapeutic level in the posterior segment of the eyes. This draws attention to expand on the gCD application in ocular corticosteroid delivery and discover new use of gCD as drug carrier for drug candidates in eye disease. It is well known that physicochemical properties of lipophilic drug, e.g., solubility, can be changed when they form complex with gCD without covalent bond involved in the complexation. Most complex formations result in improvement of the drug´s solubility or stability or both in water leading to the enhancement of the drug bioavailability at target organ after administration. Normally, aqueous mucus layer covering epithelium of many organs hampers lipophilic drug to dissolve and partition in this layer. When the aqueous solubility of poorly water-soluble drugs is improved, availability of the drug molecule is greater at mucus-epithelium interface. Similarly, the aqueous-mucin layer of tear film covering ocular epithelium is the frontline physical barrier of the lipophilic drug. In ophthalmic formulation development, not only solubilizing property of excipient but the ability of vehicle to enhance drug permeability is also important for drug delivery system to overcome complicated barriers of the eyes. Therefore, this project will explore into the foundation of the gCD application as a drug carrier for topical delivery to the eye and seek feasibility of incorporation of new drug candidate in gCD-based carrier platform.
The objectives of this study were to improve water solubility of the lipophilic drug, dovitinib free base using gCD; to examine physicochemical properties of the drug in the presence of gCD and other pharmaceutical excipients; to determine the effect of gCD on drug permeation; as well as to investigate the factors affecting drug permeation through lipophilic membrane and drug release from gCD-based carrier.
Phase-solubility technique was used to form complex of the lipophilic model-drugs (dovitinib and dexamethasone) in gCD aqueous media, determine the aqueous solubility of the drugs in relevant studied condition, and prepare sample solutions for the permeation studies. To improve the aqueous solubility of dovitinib, single technique such as gCD complexation and salt formation, and combination techniques of gCD complexation and ionization were evaluated. Five acids were used to investigate salt formation and ionization of dovitinib base by pH-solubility studies. In optimization, three different concentrations of each acid were added to the complexing media containing two different gCD concentrations and the enhanced solubility was determined. Lipophilicity and stability were also examined in the presence and absence of pharmaceutical excipients, i.e., gCD, counterions, buffers. Furthermore, the solid fraction found in spontaneous suspensions of the dovitinib/acid/high gCD concentration was characterized in terms of the contents of dovitinib and gCD, size of solid particles, and form of dovitinib and gCD using high performance liquid chromatography, laser scattering technique, and Fourier-transform infrared spectroscopy, respectively. Finally, in-vitro permeation studies were carried out using vertical Franz diffusion cells, artificial lipophilic membranes, and a single layer of cellulose dialysis membranes. A particularly experimental condition was designed to separately investigate the gCD effect on drug permeation, formulation factors affecting drug permeation, and drug release from gCD-based carrier.
Solubility studies showed that salt formation with counterions increased the aqueous solubility of dovitinib greatly rather than complexation with gCD. Lactic acid improved the solubility up to many ten-thousand folds and its solubility enhancement was the highest among other acids used. When the combined techniques were used, the total solubility, i.e., the intrinsic solubility of the pure drug and solubility of the drug/gCD complex, was increased due to the improvement of apparent intrinsic solubility as expected. Surprisingly, a synergistic effect of solubilization was found when dovitinib was dissolved in the acidic aqueous solutions containing lactic/gCD, phosphoric/gCD and maleic/gCD at low concentration of gCD (38.6 mM). At high gCD concentration (154.2 mM), the dissolved dovitinib and dovitinib/gCD complex increased with increasing acid concentration. In contrast, some samples containing relatively low acid concentration were suspension. Thus, the contents of dovitinib and gCD in solid fraction were determined and two suspensions obtained from lactic acid and phosphoric acid were characterized. The results revealed that solid fraction contained gCD content more than dovitinib content. The solid particles in those suspensions were in a few micrometers of size and in a complex form with gCD. This indicated that spontaneous suspension of dovitinib/acid/154.2 mM gCD obtained from lactic acid and phosphoric acid contained self-assembled microparticles of dovitinib/gCD complexes. Moreover, lipophilicity of dovitinib in the presence of acidic counterions was determined at different pH and described with log10 of distribution coefficient, log D. It was found that the pH was the main factor influencing the log D of the ionizable dovitinib. The counterions can affect the log D of the ionized dovitinib but have a negligible impact on the log D of the unionized drug. The stability studies also showed that gCD could stabilize dovitinib at relatively low pH. The stabilizing effect of gCD was more noticeable than the buffer effect.
The drug permeation studies through the artificial lipophilic membrane were performed to investigate the gCD effect on permeation of dexamethasone and the impact of formulation factor on dovitinib permeation. The results of dexamethasone permeation showed that drug flux increased with increasing dissolved dexamethasone and gCD concentration. The dexamethasone flux increased until reaching the maximum at the highest solubility of the drug then decreased dramatically when excess gCD was found in the dexamethasone-saturated solution. This indicated that the highest permeation was obtained when both the thermodynamic activity of the drug and the soluble drug concentration were at maximum. However, the results from dovitinib permeation showed different phenomenon. The dovitinib flux and apparent permeability coefficient (Papp) decreased when the self-assembled nanoparticles existed. In addition, the flux and Papp further decreased when the nanoparticle was larger in size and concentration. Therefore, the formulation factor such as particle size should be considered during formulation design.
The study of drug release was performed using a single layer of cellulose dialysis membrane. Original intention of this study was to investigate the effect of alpha-amylase enzyme, which has been found in tear fluid, on dexamethasone release from gCD-based carrier under mimic tear pH and ocular surface temperature. However, unexpected factor was found with additive influence on the alpha-amylase effect. From the observation in the release studies, it can explain that the faster release of dexamethasone from aqueous solution containing relatively low gCD, i.e., 1–4 mM and alpha-amylase enzyme was due to the additive effect of dilution and alpha-amylase catalysis.
In conclusion, gCD showed functional flexibility as an excipient depending upon its concentration and the presence of additives. It could both solubilize and stabilize the lipophilic drug of interest, dovitinib through forming complex and self-assembled gCD particles. gCD-based carrier can either enhance or hamper the drug permeation, but the effect can be optimized. Furthermore, drug release can be enhanced when alpha-amylase is present in diluted gCD solution. These findings suggest that gCD can be used as a drug carrier for lipophilic drug in topical delivery to the eyes.
-sýklódextrín (CD) hefur nýlega verið notað sem hjálparefni fyrir lyf til
staðbundinnar notkunar í auga. Greint hefur verið frá mikilli þéttni barkstera í
ýmsum augnvefjum eftir staðbundna notkun augndropa, einkum eftir að
meðferðarþéttni hefur verið náð í aftari hluta augna. Þetta gefur tilefni til að
kanna frekari notkun CD við gjöf barkstera í auga og uppgötva nýja
notkunarmöguleika CD sem lyfjalosunarkerfis fyrir önnur hugsanleg lyf við
augnsjúkdómum. Það er vel þekkt að eðlisefnafræðilegir eiginleikar
gestasameindar, til dæmis fitusækið lyf og/eða CD, geta breyst þegar þau
mynda flóka. Þetta gerist þrátt fyrir að ekkert samgilt tengi taki þátt í myndun
efnaflókans milli lyfsins og CD. Flestir efnaflókar leiða til aukinnar leysni
og/eða aukins stöðugleika lyfsins í vatni, sem aftur leiðir til aukins aðgengis
lyfsins að marklíffærinu eftir gjöf. Vatnskennda slímlagið sem liggur yfir
þekjuvef margra líffæra hindrar yfirleitt upplausn fitusækna lyfsins og
dreifingu þess í slímlaginu. Með því að bæta vatnsleysni lyfja sem leysast illa
upp í vatni eykst enn fremur aðgengi að lyfjasameindinni á mótum slímlags
og þekju. Á svipaðan hátt myndar vatnskennt slímlag tárahimnunnar sem
þekur augnþekjuna helstu efnislegu hindrunina fyrir fitusækna lyfið. Við þróun
augnlyfja er ekki aðeins mikilvægt að auka leysnieiginleika hjálparefna heldur
einnig að bæta gegndræpi lyfja til að lyfjalosunarkerfið komist fram hjá
flóknum hindrunum í augum. Þar af leiðandi felur þetta verkefni í sér
rannsókn á notkun CD sem lyfjaferju fyrir staðbundna notkun í augum og að
leita hagkvæmra leiða fyrir ný hugsanleg lyf sem CD getur flutt með sama
hætti.
Markmið rannsóknarinnar var að bæta vatnsleysni fitusækna lyfsins
dóvitiníbs, sem er óbundinn basi, með því að nota CD til að rannsaka
eðlisefnafræðilega eiginleika lyfsins samhliða CD og öðrum hjálparefnum
með það fyrir augum að ákvarða áhrif CD á gegndræpi lyfja. Enn fremur var
markmiðið að rannsaka þá þætti sem hafa áhrif á gegndræpi lyfja í gegnum
fitusæknar himnur og losun lyfs frá CD-lyfjaferju. Fasaleysniaðferð (e.
phase-solubility technique) var notuð á vatnslausn með CD til að mynda
flóka úr fitusæknum lyfjum í líkani (e. model-drugs) (dóvitiníb og
dexametasón), ákvarða vatnleysni lyfjanna á viðkomandi rannsóknarformi og
að undirbúa sýnislausnir fyrir gegndræpirannsóknir. Metin var virkni stakra
aðferða, svo sem myndun CD-flóka og myndun salta, og samsettra aðferða
með myndun CD-flóka og jónun til að bæta vatnsleysni dóvitiníbs. Fimm
sýrur voru notaðar til að rannsaka saltmyndun og jónun dóvitiníb-basa með
rannsóknum á leysanleika tengdum sýrustigi (e. pH-solubility). Fimm
iv
mótjónum með þremur mismunandi þéttnigildum var bætt við flókalausnina
sem innihélt CD með tveimur mismunandi þéttnigildum og aukin leysni var
svo ákvörðuð út frá því. Auk þess voru fitusækni og stöðugleiki skoðuð bæði
með og án hjálparefna, þ.e. CD, mótjóna, jafnalausna. Enn fremur var
eiginleikum brota á föstu formi sem fundust í dreifu með dóvitiníbi/sýru/CD í
mikilli þéttni lýst með hliðsjón af magni dóvitiníbs og CD með því að nota
háþrýstivökvaskiljun, stærð föstu agnanna var lýst með ljósdreifigreiningu
með leysigeisla og formi dóvitiníbs og CD var lýst með Fouriervörpunarlitrófsgreiningu með innrauðu ljósi. Að lokum var in vitro prófun á
gegndræpi framkvæmd í lóðréttu Franz dreifihólfi (e. Franz diffusion cell) með
efnasmíðaðri fitusækinni himnu og stöku lagi af skilunarhimnu úr sellulósa.
Sérstakar tilraunaaðstæður voru hannaðar til að rannsaka sérstaklega áhrif
CD á gegndræpi lyfs, myndunarþætti sem hafa áhrif á gegndræpi lyfs og
losun lyfs frá CD-lyfjaferju.
Rannsóknir á leysni sýndu að saltmyndun með mótjón eykur vatnsleysni
dóvitiníbs mun meira en myndun efnaflóka með CD. Mjólkursýra bætti leysni
allt að tugþúsundfalt og var leysniaukning hennar mest af þeim sýrum sem
voru notaðar. Þegar tvær aðferðir voru notaðar samhliða jókst leysnin vegna
bættrar sýnilegrar og eðlislægrar leysni, eins og búist var við í sumum
kerfum. Hins vegar kom á óvart að samverkandi leysniáhrif komu fram þegar
dóvitiníb var leyst upp í súrum vatnslausnum sem innihéldu fosfór-/CD og
malín-/CD þar sem CD var í lágri þéttni (38,6 mM). Á sama tíma bætti
þrígilda kerfið með dóvitiníbi, mjólkursýru og CD (38,6 mM) leysni gegnum
viðbótaráhrif. Við mikla þéttni CD (154,2 mM) jókst upplausn dóvitiníbs og
dóvitiníb-/CD-flóka í takt við aukna sýruþéttni. Aftur á móti voru nokkur sýni
sem innihéldu tiltölulega lága sýruþéttni dreifur. Því var magn dóvitiníbs og
CD í föstu broti ákvarðað og tvær dreifur sem fengust úr mjólkursýru og
fosfórsýru voru greindar með hliðsjón af eiginleikum. Niðurstöðurnar leiddu í
ljós að fasta brotið innihélt meira af CD en dóvitiníbi. Föstu agnirnar í
þessum dreifum voru nokkrir míkrómetrar að stærð og á formi flóka með CD.
Þetta benti til þess að dreifa með dóvitiníbi, sýru og CD (154,2 mM) sem
fékkst úr mjólkursýru og fosfórsýru innihélt sjálfraðaðar (e. self-assemble)
öragnir af dóvitiníb-/CD-flókum. Auk þess var fitusækni dóvitiníbs ákvörðuð
þegar súrar mótjónir voru til staðar við mismunandi sýrustig og henni lýst með
log10 af dreifistuðli, log D. Í ljós kom að sýrustigið var helsti þátturinn sem
hafði áhrif á log D í jónanlegu dóvitiníbi. Mótjónirnar geta haft áhrif á log D
jónaðs dóvitiníbs en þær hafa óveruleg áhrif á log D í ójónaða lyfinu.
Rannsóknir á stöðugleika sýndu einnig að CD getur haldið dóvitiníbi stöðugu
við tiltölulega lágt sýrustig. Stöðugleikaáhrif CD voru greinilegri en áhrif
jafnalausnarinnar.
Rannsóknir á gegndræpi lyfsins í gegnum efnasmíðaða fitusækna himnu
voru gerðar til að kanna áhrif CD á gegndræpi dexametasóns og áhrif
v
myndunarþáttarins á gegndræpi dóvitiníbs. Niðurstöður fyrir gegndræpi
dexametasóns sýndu að flæði lyfsins jókst með aukinni upplausn
dexametasóns og aukinni þéttni CD. Flæðið minnkaði verulega eftir að
hámarksleysni dexametasóns var náð en hins vegar sást umframmagn af
CD. Þetta benti til þess að mesta gegndræpi hafi komið fram þegar bæði
varmafræðileg virkni lyfsins og þéttni uppleysts lyfs voru í hámarki. Hins
vegar voru niðurstöðurnar fyrir gegndræpi dóvitiníbs ólíkar. Flæði dóvitiníbs
minnkaði og sýnilegur gegndræpistuðull (Papp) þess lækkaði þegar
sjálfröðuðu nanóagnirnar voru til staðar. Auk þess minnkaði flæðið og Papp
lækkaði enn frekar þegar nanóagnir voru stærri. Þar af leiðandi skal hafa í
huga myndunarþætti á borð við stærð agna við hönnun lyfjasamsetningar.
Rannsóknin á losun lyfsins var framkvæmd með því að nota eitt lag af
skilunarhimnu úr sellulósa. Upphaflegur tilgangur þessarar rannsóknar var að
kanna áhrif -amýlasaensíms, sem fundist hefur í táravökva, á losun
dexametasóns frá CD-lyfjaferju við aðstæður sem líkja eftir sýrustigi tára og
yfirborðshita augans. Hins vegar fannst óvæntur þáttur sem hefur
viðbótaráhrif á virkni -amýlasa. Samkvæmt niðurstöðum úr
losunarrannsóknunum getur þetta skýrt hraðari losun dexametasóns úr
vatnslausn sem inniheldur CD í tiltölulega lágri þéttni, þ.e. 1–4 mM og -
amýlasaensím á þann veg að hraðari losun er tilkomin vegna viðbótaráhrifa
þynningar og hvötunar -amýlasa.
Lokaniðurstaðan er sú að CD hefur sveigjanlega virkni sem fer eftir þéttni
þess og því hvort aukefni eru til staðar eða ekki. Það getur bæði gert
fitusækna lyfið dóvitiníb leysanlegt og haldið því stöðugu með því að mynda
flóka og sjálfraðaðar CD-agnir. Jafnvel þó CD-lyfjaferja geti bæði aukið eða
hindrað gegndræpi lyfsins er hægt að hámarka áhrifin. Enn fremur er hægt
að auka losun lyfs þegar -amýlasi er til staðar í þynntri CD-lausn. Þessar
niðurstöður benda til þess að hægt sé að nota CD sem lyfjaferju fyrir
fitusækin lyf til staðbundinnar notkunar í auga.
