Orientadores : Vanderlei Rodrigues, Luiz Candido de Souza Dias

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo

Resumo: Variações fenotípicas intra e inter-populacionais de Schistosoma mansoni ocorrem em várias áreas geográficas. A heterogeneidade genética do parasita contribui para a observada variação fenotípica na interação parasita-hospedeiro, desempenhando um importante papel na epidemiologia da doença....

Resumo: Variações fenotípicas intra e inter-populacionais de Schistosoma mansoni ocorrem em várias áreas geográficas. A heterogeneidade genética do parasita contribui para a observada variação fenotípica na interação parasita-hospedeiro, desempenhando um importante papel na epidemiologia da doença. A diferença fenotípica mais estudada, no entanto, é a resposta a quimioterapia, visto que ela é bastante relevante para o controle da esquistossomose. Com o objetivo de observar e avaliar a variabilidade genética entre linhagens brasileiras com características distintas e inferir relações filogenéticas entre elas, o DNA foi isolado de um " pool " de vermes das linhagens BH, SJ1, SJ2, 000, LE e MAP. O RAPD foi processado com 5 iniciadores com seqüências de nucleotídeos aleatórias. O RAP-PCR , por sua vez, foi realizado com o intuito de observar a variabilidade em regiões codificadoras do genoma. Os dois métodos se mostraram capazes de distinguir linhagens gerando marcadores moleculares intra-específicos. Um desses marcadores foi seqüenciado e mostrou alta homologia de nucleotídeo (99%) com uma sequência humana e 89% com gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase humana, proteína já correlacionada com a indução de resistência a reinfecção com S. mansoni e S. haematobium. O marcador G400-9 mostrou alta homologia de nuc1eotídeo, confirmada pela alta homologia de aminoácido com transposase de TNIO. Outro marcador sequenciado foi o CBH300-IO que apresentou alta homologia de nucleotídeo com o gene do ribossomo 28S. Outros marcadores interessantes foram observados na linhagem tolerante 000: 0uh250-IO e 0uh200-II, com os iniciadores RdIO (GGGTAACGCC) e RdII (GTGACTGCAG). Não detectamos marcadores específicos para a linhagem MAP, resistente ao oxamniquine, e sim um perfil eletroforético distinto com o iniciador Rd7 (TGCCGAGCTG). Na construção de árvores filogenéticas Neighbor-joining, quando foram inferidas as áreas geográficas das linhagens, obteve-se um dendograma formado por dois grupos distintos, um de linhagens paulistas e outro de mineiras. O dendograma obtido quando inferiu-se o tipo de hospedeiro intermediário revelou a formação de 3 grupos. A linhagem LE, mantida em laboratório sem retro-alimentação, pertence a um grupo externo bastante diferente dos demais. As linhagens BH, SJ1 e SJ2 foram agrupadas entre si, possivelmente em função do fluxo gênico existente entre elas, e a linhagem 000 foi estabelecida em um terceiro grupo. Estes dois últimos grupos (um formado pelas linhagens BH, SJ1 e SJ2, e outro pela linhagem 000), com linhagens de manutenção recente em laboratório ou com retroalimentação, são mais relacionadas entre si que com a LE. Acreditamos que a maior distância genética desta linhagem em relação as outras se deva a sua longa manutenção em laboratório com fixação de determinados alelos. As relações filogenéticas observadas nas árvores Neighborjoining corroboram as características fenotípicas distintas das linhagens e estas podem ser distinguidas e diagnosticadas por marcadores moleculares obtidos por RAPD e RAP-PCR

Abstract: Phenotypical variation intra and inter-populational of Schistosoma mansoni ocurred in several geographic areas. The genetic heterogenicity of the parasite contributes for phenotypic variation in the parasite-host interaction, representing an important role in the disease epidemiology. The...

Abstract: Phenotypical variation intra and inter-populational of Schistosoma mansoni ocurred in several geographic areas. The genetic heterogenicity of the parasite contributes for phenotypic variation in the parasite-host interaction, representing an important role in the disease epidemiology. The more studied phenotypic difference, however, is the response to chemotherapy, so that is very relevant in the schistosomiasis contro!. The DNA was isolated fiom a pool of worms of the strains: BH, SJ1, SJ2, 000, LE and MAP, with the finality to observe and evaluate the genetic variability among brazilian strains, with different characteristics, and infer phylogenetic relations among them. The RAPD was processed with 5 random primers. The RAPD-PCR was realized with the fmality to observe the variability in codificators regions of genome. The two methods showed to be able to distinguish, generating molecular markers of strains. One of this markers was sequenced and showed high homology of nucleotides (99%) comparing to a human sequence and 89% with human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, protein already relationed to the induction of resistance to the reinfection with S. mansoni and S. haematobium. The marker G400-9 showed high homology of nucleotides confirmaded for high homology of amino acid with transposase of TNI0. Other marker (CBH300-l0) was sequenced and apresented high homology with ribosomal 28 S gene Other interesting markers were observed in tolerant strain 000: 000250-10 and 000200-11, with the primers RdlO (GGGTAACGCC) and Rdll (GTGACTGCAG). Specific markers were not detected by us for MAP strain, resistant to oxamniquine, and a distinct PCR product profile with the primer Rd7 (TGCCGAGCTG). In the construction of phylogenetic trees Neighbor-joining, afier the geographic areas of strains were infered, a dendogram was obtained formed by two differents groups, one of paulistas strains and another of mineiras. When the type of intermediate host was infered the obtained dendogram revealed the formation of three groups. The LE strain kept in laboratory without retro-feed, belong to a external group very different fiom the others. The BH, SJ1 and SJ2 strains were grouped among them, possibly, in fimction of the genic flux existent among them, and the strain 000 was established in other group. This last two groups, with recent laboratory maintenance strains or with retro-feed, are more related among them, than to LE strain. We believed that the major genetic distance from this strain in relation to the others should be because the long maintenance in laboratory with the establishment of the allels. The phylogenetic relations observed in trees Neighbor-joining corroborate the different phenotypic characteristics of strains and this should be distinguished and diagnosed by molecular markers obtained by RAPD and RAP-PCR