Orientador: Anibal Eugenio Vercesi

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas

Resumo: A compreensão dos mecanismos de resposta imunológica do hospedeiro durante o desenvolvimento tumoral é fundamental para o estabelecimento de imunoterapias contra o câncer. Durante o desenvolvimento intraperitoneal do tumor de Walker 256, um modelo tumoral amplamente utilizado na oncologia...

Resumo: A compreensão dos mecanismos de resposta imunológica do hospedeiro durante o desenvolvimento tumoral é fundamental para o estabelecimento de imunoterapias contra o câncer. Durante o desenvolvimento intraperitoneal do tumor de Walker 256, um modelo tumoral amplamente utilizado na oncologia experimental, foram avaliadas a bioenergética mitocondrial e a homeostase de Ca2+ em linfócitos esplênicos de animais portadores do tumor, bem como os processos de proliferação e morte linfocitária. Nos ratos portadores de tumor de Walker (TB), a proliferação linfocitária predominantemente do tipo TCD8+ e o
aumento dos níveis de interleucina-2 indicaram a ocorrência de ativação linfocitária durante o desenvolvimento tumoral. O processo de ativação linfocitária acarretou produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio (EROs). Considerando que o tratamento in vitro com difenileno-iodônio inibiu a produção de EROs e aumentou os níveis da proteína cinase C fosforilada, sugere-se que a maior fonte de EROs nesta situação é a NADPH oxidase. A elevação da concentração citosólica de Ca2+ induziu acúmulo mitocondrial deste cátion. A elevação da concentração de Ca2+ intramitocondrial e a sensibilidade a oligomicina, bem como a diminuição da razão ATP/ADP, observadas em ratos TB são indicativos de estímulo do metabolismo energético. O aumento dos níveis de interferon-gama, mas não de interleucina-10, sugere que linfócitos ativados com
alta demanda energética, foram capazes de deflagrar resposta imunológica do tipo Th-1 durante o desenvolvimento tumoral. Embora linfócitos ativados apresentaram mecanismos de defesa, como maior expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 e da proteína desacopladora UCP-2, observou-se que os mesmos são mais susceptíveis aos danos celulares causados pela indução de estresse oxidativo in vitro. Desta forma, linfócitos isolados de baço de ratos TB apresentaram elevada taxa de morte celular por necrose após o tratamento com tert-butil hidroperóxido, um indutor clássico de estresse oxidativo. Desferoxamina, um antioxidante e quelante de Fe2+, preveniu a ocorrência de necrose, indicando a participação de EROs no processo de morte celular. Contrariamente ao FK506, a ciclosporina A inibiu de maneira significativa à morte celular. FK506 e ciclosporina A são importantes antagonistas da via da calcineurina, entretanto somente a ciclosporina A previne a formação do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (MPT). Desta forma, a indução de morte celular do tipo necrose em linfócitos ativados é via MPT. Considerando a ocorrência de linfopenia durante a quimioterapia associada ao estresse oxidativo, estes dados contribuem para a compreensão dos mecanismos que levam a linfopenia freqüentemente observada durante o tratamento quimioterápico em indivíduos portadores de tumor. Ainda, foi demonstrado que o influxo celular de Ca2+ exerce papel central no controle da resposta imunológica. A administração de verapamil, um inibidor de influxo de Ca2+ via canal tipo-L, preveniu a ativação linfocitária, bem como os mecanismos de defesa (níveis elevados de Bcl-2 e UCP-2), entre outros parâmetros estudados. Ainda, a administração de verapamil nos ratos TB contribuiu para o aparecimento de efeitos paraneoplásicos, a exemplo da anorexia e anemia. Em conjunto, os resultados deste estudo sugerem que linfócitos do hospedeiro são capazes de exercer o processo de vigilância imunológica, envolvendo o influxo celular de Ca2+ e a participação mitocondrial com a ativação da fosforilação oxidativa, que contribui para a demanda energética requerida pelo processo de resposta imune durante o desenvolvimento tumoral

Abstract: The understanding of the mechanisms of host immune response during the tumoral development is essential to establish the immunotherapy against cancer. During the intraperitoneal development of Walker 256 tumor, the tumor model widely used in experimental oncology, the mitochondrial...

Abstract: The understanding of the mechanisms of host immune response during the tumoral development is essential to establish the immunotherapy against cancer. During the intraperitoneal development of Walker 256 tumor, the tumor model widely used in experimental oncology, the mitochondrial bioenergetics and Ca2+ homeostasis were evaluated in splenic lymphocytes from adult Wistar rats, as well as the processes of lymphocyte proliferation and death. In Walker 256 tumor bearing rats (TB) rats, the lymphocyte proliferation predominantly TCD8+ type and the increase in the levels of interleukin-2 indicated that the tumor development induces the process of lymphocyte activation. The process of lymphocyte activation induced reactive oxygen species (ROS) overproduction. Considering that the treatment of TB rats with diphenylene iodonium in vitro inhibited ROS overproduction and increased the levels of protein Kinase C phosphorylation, the NADPH oxidase was suggested as the main ROS source under this situation. The increase in cytosolic free Ca2+ concentration induced mitochondrial uptake of this cation. The increase in intramitochondrial Ca2+ concentration and in the sensitivity
to oligomycin, as well as the decrease in ATP/ADP ratio, observed in TB rats, indicate a stimulation of the energetic metabolism. The increase in interferongamma, but not interleukin-10, suggests that the activated lymphocytes with high energy demand are able to promote the Th1-type immune response during the tumor development. Although the activated lymphocytes showed protective mechanisms, such as the higher levels of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and uncoupling protein UCP-2, it was observed that they are more susceptible to cellular damage caused by the induction of oxidative stress in vitro. Spleen lymphocytes isolated from TB rats presented an increase in necrotic cell death rate
after treatment with tert-butyl hydroperoxide, a classical inductor of oxidative stress. Desferoxamine, an antioxidant and Fe2+ chelator, prevented the induction of cell death indicating the participation ROS in the process of cell death. However, cyclosporin A but not FK506 inhibited significantly the necrotic cell death. FK506 and cyclosporin A are important antagonists of calcineurin pathway, but only cyclosporin A inhibits the mitochondrial permeability transition (MPT). Therefore, it was suggested that the induction of necrotic cell death in activated lymphocytes is by MPT. Considering the processes of lymphopenia during the chemotherapy associated with oxidative stress, these data could help in the understanding of mechanisms that leads to lymphopenia frequently observed during the chemoterapic treatment of tumor bearing patients. Moreover, it was demonstrated that Ca2+ influx play a central rule in the control of immune response. The administration of verapamil, an inhibitor of Ca2+ influx through L-type Ca2+ channel, prevented the lymphocyte activation and the defense mechanisms (Bcl-2 and UCP-2) triggered by tumor development, between other parameters evaluated. Moreover, the administration of verapamil in TB rats contributes to the occurrence of paraneoplastic effects, such as anorexia and anemia. Together, these results suggest that lymphocytes are able to exert the immunologic vigilance process involving cell Ca2+ influx and participation of mitochondria through activated oxidative phosphorylation that sustains the energy demand required by immune response process during tumor development