Orientador: Marcelo Menossi Teixeira

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: As células de plantas são altamente organizadas e muitos processos biológicos estão associados com estruturas subcelulares específicas. A localização subcelular é uma característica chave das proteínas, visto que está relacionada com a função biológica. A determinação da localização...

Resumo: As células de plantas são altamente organizadas e muitos processos biológicos estão associados com estruturas subcelulares específicas. A localização subcelular é uma característica chave das proteínas, visto que está relacionada com a função biológica. A determinação da localização subcelular usando a predição é uma estratégia altamente desejável, principalmente porque as abordagens experimentais demandam um tempo considerável. Com o objetivo de desenvolver um método para melhorar a predição de localização subcelular, diversos algoritmos foram integrados visando à exploração ótima do potencial de cada um. O desempenho com 90% de exatidão deste novo método foi claramente superior a todos os métodos utilizados em sua criação. Usando esta estratégia foi realizada a primeira análise em larga escala da localização subcelular do proteoma de cana-de-açúcar (com 11.882 proteínas preditas), sendo encontrado que a maioria das proteínas estão localizadas em quatro compartimentos: núcleo (44%), citoplasma (19%), mitocôndria (12%), e extracelular (11%). Adicionalmente foi observado que cerca de 19% das proteínas são localizadas em múltiplos compartimentos. Outros resultados foram capazes de identificar um conjunto de proteínas de cana-de-açúcar que podem apresentar duplo direcionamento pelo uso de variações na extremidade amino. Utilizando expressão transiente em células da epiderme de cebola, foi investigada a localização subcelular de 96 proteínas de cana com fusão a proteína GFP. As construções contendo fusão amino- e carboxi-terminal dos genes foram expressas, e a localização das proteínas de fusão foi detectada por microscopia de fluorescência. É relatado também a caracterização do gene ScBAK1, um receptor do tipo quinase com repetições ricas em leucina, que apresenta similaridade de seqüência com o gene brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. Foi mostrado que transcritos desse gene se acumulam em níveis muito mais altos nas células da bainha do feixe vascular do que nas células do mesófilo, e que a fusão ScBAK1-GFP é localizada na membrana plasmática. Essa distribuição espacial e esse padrão de expressão indicam que a ScBAK1 pode estar potencialmente envolvida em cascatas de sinalização celular intermediadas por altos níveis de açúcar na folha. Ainda considerando estudos de localização subcelular, é conhecido que seqüências de nucleotídeos que flanqueiam o códon de início da tradução afetam a eficiência traducional dos mRNA, e podem indicar a presença de sítios de inicio de tradução (TIS) alternativos. O
multi-direcionamento pode ser um reflexo da variabilidade traducional destas outras formas da proteína. Neste estudo foi desenvolvido um método computacional para investigar o uso de TISs alternativos na síntese de novas variantes protéicas que podem apresentar localização subcelular diferente. Visando contribuir para o nosso entendimento da complexidade do genoma da cana-de-açúcar, foi empregada uma análise em larga escala dos TIS nesta espécie. Também é demonstrado que os transcritos com expressão induzida apresentam um forte TIS quando comparados com os reprimidos, e que os transcritos constitutivos possuem uma alta freqüência de TIS alternativos. O mesmo ocorre para os genes com altas taxas evolutivas, e transcritos específicos de folhas e entrenós, levantando a hipótese de que esses genes possam codificar diferentes polipeptídeos

Abstract: Plant cells are highly organized and many biological processes are associated with specialized subcellular structures. Subcellular localization is a key feature of proteins, since it is related to biological function. The determination of subcellular localization using computational...

Abstract: Plant cells are highly organized and many biological processes are associated with specialized subcellular structures. Subcellular localization is a key feature of proteins, since it is related to biological function. The determination of subcellular localization using computational prediction is a highly desirable strategy because experimental approaches are time-consuming. In order to develop a method for the enhanced prediction of subcellular localization, the outputs of some prediction tools were integrated so as to optimally exploit the potential of each one. The prediction performance (with 90%of accuracy) of this new method was clearly superior to all the methods used to create the predictor. Using this method, the first in silico genome-wide subcellular localization analysis was performed for sugarcane (with 11,882 predicted proteins). It was found that most of the proteins are localized to four compartments: nucleus (44%), cytosol (19%), mitochondria (12%), and secretory destination (11%). It is also shown that about 19%of the proteins are localized to multiple compartments, and that a potential set of sugarcane proteins can show dual targeting by use of N-truncated form of proteins. The subcellular localization of 96 sugarcane proteins fused with GFP were evaluated using transient expression in onion epidermal cells. Constructs containing the Nand C-terminal fusion of genes encoding both endogen and GFP proteins were transiently expressed, and the localization of the fusion proteins were detected by fluorescent microscopy. It was reported the characterization of ScBAK1, a sugarcane leucine-rich repeat receptor-like kinase, with sequence similarity to brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. We have found that ScBAK1 transcripts accumulated at higher levels in bundle-sheath than in mesophyll cells. ScBAK1-GFP fusions were localized to the plasma membrane. This spatial distribution and expression pattern indicates that ScBAK1 might be potentially involved in cellular signaling cascades mediated by high levels of sugar in this organ. The nucleotide sequence flanking the translation initiation codon affects the translational efficiency of eukaryotic mRNAs, and may indicate the presence of an alternative translation initiation site (TIS) to produce proteins with different properties. Multi-targeting may reflect the translational variability of these other protein forms. In this study it was also developed a computational method to investigate the usage of alternative TISs for the synthesis of new protein variants that might have different subcellular localization. To contribute to our understanding of the genome complexity of sugarcane, we undertook a genome wide TIS analysis in sugarcane data. It is demonstrated that up-regulated transcripts show a stronger TIS when compared with the down-regulated, and that ubiquitous transcripts have a high frequency of alternative TIS in the next downstream AUG codon. The same occurs for fast-evolving genes, and leaf and internodes specific transcripts, that may encode different polypeptides by N-terminal polymorphism