Orientadores: Ana Carolina de Mattos Zeri, Nilson Ivo Tonin Zanchin

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Proteínas da família SBOS (Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) ocorrem largamente na natureza e s.ão bastante conservadas, apresentando ortólogas em Archaea e eucariotos. Estudos de análises genômica e biofísica tem relacionado a SBOS com o metabolismo de RNA e biosíntese de ribossomos. O...

Resumo: Proteínas da família SBOS (Shwachman-Bodian-Diamond Syndrome) ocorrem largamente na natureza e s.ão bastante conservadas, apresentando ortólogas em Archaea e eucariotos. Estudos de análises genômica e biofísica tem relacionado a SBOS com o metabolismo de RNA e biosíntese de ribossomos. O gene ortólogo da SBOS de Archaea está localizado em um operon conservado que contém genes do processamento de RNA; estudos de perfil de expressão gênica tem agrupado o gene da proteína SBOS de Saccharomyces cerevisiae, Sdo1p, com fatores do processamento de rRNA e estudos de análise proteômica identificaram a interação da proteína Sdo1p com fatores da biossíntese de ribossomos; ortólogas de planta contém um C-terminal estendido apresentando motivo de ligação a RNA. Mutações identificadas no gene SBDS tem sido relacionadas com a síndrome Shwachman-Oiamond (80S), uma doença caracterizada por insuficiência exócrina pancreática e disfunção na medula óssea, cujos pacientes apresentam grandes chances de desenvolver leucemia. SOS representa, portanto, um importante modelo para entender os processos envolvidos no desenvolvimento da leucemia. O objetivo principal desse trabalho consistiu na caracterização estrutural e funcional de proteínas da família SBOS. Foram realizados ensaios de cristalização com ortólogas ; da SBOS de Archaea, levedura, tripanossoma e humana. A SBOS de Pyrococcus abyssi foi cristalizada, porém os cristais difrataram a baixa resolução (3,50 A). A ' caracterização da SBOS ortóloga de Trypanosoma cruzi (TcSBOS) mostrou que esta, proteína contém uma região C-terminal estendida. Ensaios de proteólise limitada,' dicroismo circular e espectroscopia por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) indicaram que a região adicional da TcSBOS se comporta como um fragmento de proteína intrinsicamente desenovelado, responsável pela interação da TcSBOS com RNA, verificada por ensaios de Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Também foi realizada a determinação da estrutura da ortóloga humana (HsSBOS) em solução por espectroscopia de RMN. A proteína HsSBOS é composta de três domínios bem estruturados, apresentando mobilidade conformacional entre os domínios N-terminal e central. Experimentos de titulação de RNA, novamente utilizando-se RMN, possibilitaram a confirmação da interação direta da SBOS humana com RNA. A região de ligação ao RNA foi identificada no N-terminal da proteína, região bastante conservada na família e considerada o principal alvo das mutações relacionadas à doença SDS

Abstract: The Shwachman-Bodian-Oiamond syndrome (SBOS) protein family occurs widely in nature and is highly conserved, with orthologues in Archaea and eukaryotes. Genomic and biophysical studies have suggested involvement of this protein in RNA metabolism and in ribosome biogenesis. Archaeal SBOS...

Abstract: The Shwachman-Bodian-Oiamond syndrome (SBOS) protein family occurs widely in nature and is highly conserved, with orthologues in Archaea and eukaryotes. Genomic and biophysical studies have suggested involvement of this protein in RNA metabolism and in ribosome biogenesis. Archaeal SBOS orthologue genes are located within highly conserved operons that include RNA-processing genes; transcriptional profiling analysis has clustered the yeast ortholog protein Sdo 1 p with rRNA processing factors and proteomic analysis have identified potential interactions between Sd01 p and ribosome biogenesis factors; several plant SBOS orthologues contain extended C-terminal region with putative RNA binding motif. Mutations in the SBDS gene are associated to the Shwachman-Oiamond syndrome (SOS), arare multisystem disorder characterized by exocrine pancreatic insufficiency, bone marrow dysfunction, and an increased risk of acute myeloid leukemia. SOS therefore represents an extremely useful model for understanding leukaemogenesis. The objective of the present work was the structural and functional characterization of the SBOS protein family. SBOS orthologues from Archaea, yeast, trypanosomatid and human were assayed for crystallization. The Archaeal SBOS orthologue, PaUPF0023 in Pyrococcus abyssi, was crystallized, but the crystals 'diffracted to a relatively low resolution (3.50 A). Characterization of the Trypanosoma cruzi SBOS ortholog (TcSBOS) by using limited proteolysis, circular dichroism and NMR analyses indicated that the C-terminal additional region of TcSBOS behaves as a natively unfolded protein segment, responsible for TcSBOS-RNA interaction activity in electrophoretic mobility shift assays. We have also determined the solution structure and backbone dynamics of the human SBOS protein using NMR spectroscopy. The overall structure of human SBOS comprises three well-folded domains with conformational exchange in the linker between the N-terminal and the central domains. RNA titration experiments using NMR spectroscopy provide evidence that human SBOS interacts with RNA via the N-terminal domain, a conserved region in the SBOS family and the most frequent target for SOSassociated mutations