Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A substituição de combustíveis fósseis por combustíveis renováveis é cada vez mais relevante devido à necessidade de atenuar os impactos provocados pela emissão de gases que promovem efeito estufa. A produção de etanol no Brasil gera subprodutos como bagaço e palha derivados de...

Resumo: A substituição de combustíveis fósseis por combustíveis renováveis é cada vez mais relevante devido à necessidade de atenuar os impactos provocados pela emissão de gases que promovem efeito estufa. A produção de etanol no Brasil gera subprodutos como bagaço e palha derivados de cana-de-açúcar, empregados para produção de etanol de segunda geração. A biomassa lignocelulósica é submetida à sacarificação enzimática para que açúcares fermentescíveis sejam liberados, etapa que gera custos elevados devido a fatores como a atenuação da ação enzimática provocada pela lignina. Aditivos aos coquetéis enzimáticos podem contribuir com a diminuição da adsorção improdutiva dessas enzimas, mas podem agregar novos custos à produção. Com isso, o objetivo desse trabalho foi identificar uma proteína ainda não caracterizada que possa contribuir com a melhoria do desempenho de coquetéis enzimáticos aplicados na sacarificação de biomassas. Análises in silico e ensaios in vitro foram realizados. Inicialmente bibliotecas de RNA-Seq de diferentes linhagens de "Trichoderma reesei" (QM6a, QM9414, RUT-C30 e VTT-D 00775) foram selecionadas para construção de redes de genes co-expressos. Módulos de genes altamente correlacionados foram obtidos e a prospecção ocorreu pela detecção dos módulos que continham maior proporção de genes que codificam hidrolases glicosídicas (GHs). Dessa forma, foi possível evidenciar uma proteína ainda não caracterizada, expressa em celulose e com alta quantidade de prolinas em sua composição. Foi suposto que a proteína rica em prolinas (PRP) pode promever o bloqueio da lignina e diminuir a adsorção improdutiva de enzimas de um coquetel. O gene que a codifica foi selecionado e a proteína se tornou candidata à etapa de caracterização funcional. O gene alvo foi clonado e expresso por meio do vetor pEXPYR e Aspergillus nidulans A773 foi transformado. Uma colônia transformante foi selecionada para indução da expressão da PRP. O extrato protéico foi obtido e aplicado no ensaio qualitivo de ligação à lignina para avaliar a função proposta para a PRP. A colônia tranformante utilizada foi validada e foi considerada como um falso-positivo. Por isso, não foi possível caracterizar a função de bloqueio de lignina proposta para a PRP. Outros transformantes viáveis foram obtidos para futuros ensaios

Abstract: Replacement of fossil fuels with renewable fuels is increasingly relevant because to mitigate the impacts of greenhouse gas emissions is necessary. Ethanol production in Brazil generates byproducts such as bagasse and straw from sugarcane, used to produce second generation ethanol....

Abstract: Replacement of fossil fuels with renewable fuels is increasingly relevant because to mitigate the impacts of greenhouse gas emissions is necessary. Ethanol production in Brazil generates byproducts such as bagasse and straw from sugarcane, used to produce second generation ethanol. Lignocellulosic biomass is subjected to enzymatic saccharification for realeae of fermentable sugars, which generates high costs due to factors such as attenuation of enzymatic action caused by lignin. Additives to enzymatic cocktails may contribute to the reduction of unproductive adsorption of these enzymes, but may add new costs to production. Thus, the objective of this work was to identify an uncharacterized protein that can improve performance of enzymatic cocktails applied in the biomass saccharification. In silico analysis and in vitro assays were performed. Initially, RNA-Seq libraries from different "Trichoderma reesei" strains (QM6a, QM9414, RUT-C30 and VTT-D 00775) were selected to construct co-expressed gene networks. Highly correlated gene modules were obtained and prospecting occurred by detecting the modules that contained the highest proportion of genes encoding glycoside hydrolases (GHs). A protein not yet characterized was evidenced which was expressed in cellulose and has a high amount of prolines in its composition. It has been assumed that proline-rich protein (PRP) might act as a lignin blocker and decrease unproductive enzyme adsorption from an enzymatic cocktail. The gene encoding it was selected and the protein became a candidate for the functional characterization step. The target gene was cloned and expressed by pEXPYR vector and Aspergillus nidulans A773 was transformed. A tranformant colony was selected for induction of PRP expression. A protein extract was obtained and applied in the qualitative lignin binding assay to evaluate the proposed PRP function. The transformant colony used was validated and was considered as false positive. Therefore, it was not possible to characterize the proposed lignin block function for PRP. Other viable transformants were obtained for future analysis

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