Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: A hemoglobinopatia, anemia falciforme (AF), apresenta uma fisiopatologia complexa que resulta num estado inflamatório crônico, fundamental para o início e propagação dos processos vaso-oclusivos associados à doença, bem como muitas das suas variáveis manifestações, como a síndrome torácica...

Resumo: A hemoglobinopatia, anemia falciforme (AF), apresenta uma fisiopatologia complexa que resulta num estado inflamatório crônico, fundamental para o início e propagação dos processos vaso-oclusivos associados à doença, bem como muitas das suas variáveis manifestações, como a síndrome torácica aguda, hipertensão pulmonar, AVC e nefropatia. Acredita-se que o estado inflamatório crônico da AF seja resultado de processos de hemólise intravascular e de isquemia/reperfusão; por sua vez, o processo vaso-oclusivo é desencadeado pela adesão dos glóbulos vermelhos e leucócitos ao endotélio da microcirculação, formando uma barreira física para o sangue. Atualmente, o tratamento da AF é limitado à terapia de transfusão de eritrócitos, transplante de células tronco-hematopoiéticas e alguns farmacoterápicos (como a hidroxiureia) que mostram eficácia em pacientes AF. Acreditamos que a formação de estruturas do inflamassoma nos leucócitos de indivíduos com AF possa contribuir de forma significativa para o seu estado inflamatório. O inflamassoma é um complexo proteico multimérico formado em células inflamatórias, sendo constituído muitas vezes por uma molécula sensora, (como a NLRP3), uma proteína adaptadora, denominada ASC (Apoptosis associated speck like protein containing a CARD), e a caspase-1 (inflamassoma clássico). A formação do inflamassoma pode ser estimulada por uma série de moléculas liberadas durante um processo infeccioso ou durante danos teciduais/desequilíbrios metabólicos; estas moléculas são conhecidas como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e padrões moleculares associados a danos (DAMPs), respectivamente. Este projeto teve como objetivo comprovar (ou não) a existência da formação de inflamassoma nos neutrófilos e monócitos de indivíduos com AF, bem como identificar os componentes deste complexo e os possíveis DAMPs que podem contribuir para a sua formação nesta doença. As técnicas utilizadas para este estudo foram: ELISA, citometria de Fluxo, imunofluorescência e microscopia confocal, citometria de fluxo com imagem, PCR quantitativo (PCRq), Western blotting, co-imunoprecipitação, cultura de células primarias e de linhagem, clonagem de plasmídeos, ensaios de transfecção e a técnica de Bimolecular fluorescence complementation. Concentrações circulantes de IL-1? e IL-18 foram encontradas significativamente elevadas na população de pacientes com AF estudada. Além disso, apresentamos dados inéditos que indicam que neutrófilos de indivíduos AF (neutrófilos AF) liberam IL-1? em uma quantidade aumentada, quando comparado a neutrófilos de indivíduos sadios. No entanto, de forma interessante, o processamento dessa citocina nos neutrófilos AF foi dependente da atividade aumentada de caspase-1, mas não da participação do sensor NLRP3 ou da molécula ASC. Assim sendo, sugerimos que o processamento de IL-1? por neutrófilos em indivíduos AF não é mediado pela formação clássica do inflamassoma NLRP3. Em monócitos de indivíduos AF, observamos o processamento e liberação de IL-1? e IL-18, mas não encontramos diferenças significativas na sua liberação para o meio extracelular em comparação aos monócitos de indivíduos sadios. No entanto, dado o número aumentado desses leucócitos na circulação de indivíduos AF, não podemos excluir a participação dos monócitos nas concentrações elevadas de IL-1? e IL-18 observadas na AF. Evidências indicam que este inflamassoma, formado em monócitos AF, é mediado pela forma clássica do inflamassoma NLRP3 e necessita do recrutamento da molécula ASC para ativação de caspase-1. DAMPs são significativamente aumentados no meio circulante em indivíduos AF; demonstramos também que o plasma de indivíduos AF é capaz de estimular a formação do inflamassoma em neutrófilos e, mais importante, é capaz de ativar a maquinaria inflamatória em células não imunes transfectadas. Esses achados são importantes para o aprimoramento da nossa compreensão da fisiopatologia da AF, uma vez que mecanismos que induzem o processamento da IL-1? amplificam as respostas inflamatórias e podem representar importantes alvos terapêuticos para a doença

Abstract: Sickle cell anemia (SCA) has a complex pathophysiology that results in a chronic inflammatory state, which plays a fundamental role in the initiation and propagation of the vaso-occlusive processes that are associated with the disease, as well as many of its variable manifestations, such...

Abstract: Sickle cell anemia (SCA) has a complex pathophysiology that results in a chronic inflammatory state, which plays a fundamental role in the initiation and propagation of the vaso-occlusive processes that are associated with the disease, as well as many of its variable manifestations, such as acute chest syndrome, pulmonary hypertension, stroke and nephropathy. It is probable that the chronic inflammatory state in SCA occurs as the result of intravascular hemolysis and ischemia/reperfusion events. Consequently, the vaso-occlusive process is initiated by the adhesion of red blood cells and activated leukocytes to the activated endothelium of the microcirculation, forming a physical barrier to blood flow. Currently, the treatment of SCA is limited to blood transfusion, hematopoietic stem cell transplant and some pharmacotherapeutics, such as hydroxyurea. We postulate that the formation of the inflammasome complex in the leukocytes of patients with SCA may potentially contribute significantly to the inflammatory state in this disease. The inflamasome is a multimeric protein complex, formed in inflammatory cells, which often consists of a sensor molecule (such as NLRP3), an adapter protein called ASC (Apoptosis associated speck like protein containing a CARD) and caspase-1. The formation of the inflammassome can be stimulated by a number of molecules released during an infectious process or during tissue damage / metabolic imbalances; these molecules are known as pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and damage associated molecular patterns (DAMPs), respectively. The aim of this project was to demonstrate the existence of inflammation in the neutrophils and monocytes of individuals with SCA, as well as to identify the components of this complex and the possible DAMPs that may contribute to inflammasome formation in this disease. The techniques used for this study were: ELISA, flow cytometry, immunofluorescence and confocal microscopy, imaging flow cytometry, quantitative PCR (PCRq), Western blotting, co-immunoprecipitation, culture of primary and lineage cells, plasmid cloning, transfection assays, and Bimolecular Fluorescence complementation. Circulating concentrations of both IL-1 ? and IL-18 were significantly elevated in the population of patients with SCA studied. Furthermore, novel findings demonstrate that neutrophils from the SCA individuals (SCA neutrophils) studied release IL-1? in increased amounts, when compared to neutrophils from healthy individuals. However, interestingly, while the processing of this cytokine in SCA neutrophils was dependent on increased caspase-1 activity, it was independent of the participation of NLRP3 and the ASC molecule. Therefore, we suggest that the processing of IL-1? by neutrophils in SCA individuals is not mediated by the classic formation of the inflammatory molecule, NLRP3. In monocytes from SCA individuals, we observed the processing and release of IL-1? and IL-18, but we did not find significant differences in their release to the extracellular medium, as compared to monocytes from healthy individuals; however, given the increased numbers of these leukocytes in the SCA circulation, we cannot exclude the participation of the monocytes in the elevated concentrations of IL-1? and IL-18 observed in SCA. The inflammassome observed in SCA monocytes appears to be mediated by the classical NLRP3 inflammasome with recruitment of the ASC molecule for activation of caspase-1. Circulating DAMPs are significantly augmented in SCA individuals, and we also showed that the plasma of SCA individuals is able to stimulate the formation of inflammassome in neutrophils and, importantly, is able to activate the inflammassome machinery in transfected non-immune cells. These findings are of importance for the improvement of our understanding of the pathophysiology of SCA, since mechanisms that induce IL-1? processing amplify inflammatory responses and may constitute important therapeutic targets for the disease

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