Orientador: Denise Vaz de Macedo

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O treinamento intensificado (overtraining - OT), resultado de um aumento na frequência de treinos diários com a consequente diminuição no período de descanso entre as sessões pode produzir dois estados diferenciados em relação ao desempenho: um estado de manutenção ou mesmo ligeiro aumento...

Resumo: O treinamento intensificado (overtraining - OT), resultado de um aumento na frequência de treinos diários com a consequente diminuição no período de descanso entre as sessões pode produzir dois estados diferenciados em relação ao desempenho: um estado de manutenção ou mesmo ligeiro aumento (funcional overreaching - FOR) ou um estado de perda do condicionamento previamente adquirido (non funcional overreaching - NFOR). Estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa sugerem que a dinâmica mitocondrial está na gênese de ambos os processos. O objetivo deste trabalho foi analisar a possível existência de um sinal pró-apoptótico no músculo gastrocnêmio vermelho de animais classificados como NFOR em comparação com o grupo classificado como FOR após um protocolo de OT em esteira. Nossa hipótese é que a sinalização pró apoptótica induzida por um aumento nos níveis de estresse oxidativo explicaria o fluxo autofágico basal reduzido observado anteriormente na musculatura dos animais NFOR. A presente dissertação está dividida em 2 capítulos. No capítulo 1 apresentamos os resultados referentes a proteínas relacionadas ao processo autofágico e apoptótico induzidas por Espécies Reativas de Oxigênio (LC3 I e LC3 II, JNK1/2, p53, caspase 3) nos animais FOR e NFOR. O protocolo de overtraining foi realizado em colaboração cientifica com o Laboratório de Fisiologia de Equinos e Farmacologia (Unesp-Jaboticabal). O protocolo originalmente proposto (Hohl et al.,2009) prediz um período de 60h de descanso após o último teste de exaustão para a análise das amostras de ambos os grupos de animais. No entanto, a despeito da evidente existência de 2 grupos de animais diferenciados em relação ao desempenho, o sacrifício dos animais e a concomitante retirada das amostras de músculo imediatamente após o teste de desempenho claramente contaminaram a análise da resposta crônica frente ao protocolo de OT com a resposta aguda ao teste de exaustão. Essa conclusão foi evidenciada pela ausência de diferenças na atividade da enzima citrato sintase e razão LC3II/I nos grupos FOR e NFOR. Observamos nos animais NFOR uma redução do conteúdo de pró-caspase-3 mitocondrial com concomitante aumento de seu fragmento no citosol associado a maiores níveis de pró-caspase-3 citosolica. Esta alteração pode representar a clivagem da caspase-3 nas mitocôndrias e sua translocação para o citosol, sendo este um mecanismo associado a sinalização apoptótica. Observamos também maiores níveis da proteína p53 na fração citosólica do grupo NFOR. A localização dessas proteínas no citosol pode interferir na síntese de autofagossomos, uma vez que a ação sinérgica entre p53 e caspase-3 pode inibir proteínas do maquinário autofágico, evidenciado pela menor razão LC3II/I no grupo NFOR. Tal interferência poderia explicar a queda no desempenho no grupo NFOR. Somente a repetição do protocolo com um outro grupo de animais e a observância do tempo correto de descanso após o teste de exaustão podem confirmar ou refutar nossa hipótese. No capítulo 2 apresentamos a padronização de um protocolo de fracionamento subcelular de pequenas quantidades de amostras congeladas de tecido muscular esquelético. O congelamento de tecidos causa alterações estruturais nas células, induzindo rompimento de membranas celulares e de organelas, sendo as mitocôndrias muito sensíveis a esta condição. As análises por western blot das proteínas marcadoras das frações citosólica (alfa-tubulina), mitocondrial (VDAC1) e nuclear (histona H3) associadas a maior atividade enzimática da citrato sintase na fração mitocondrial indicaram que as modificações introduzidas no protocolo associadas aos cuidados relatados durante a homogeneização das amostras congeladas possibilitaram que quantidades pequenas (50mg) de músculo esquelético produzissem frações subcelulares com razoável grau de pureza e com maior retenção do conteúdo solúvel da fração mitocondrial. A possibilidade de utilizar pequenas quantidades de tecidos viabilizou as análises apresentadas no capítulo 1, da distribuição das proteínas relacionadas a sinalização pró-apoptótica nas frações citosolica, mitocondrial e nuclear. Além disso, possibilita o fracionamento de amostras provenientes de biopsias, facilitando o planejamento de experimentos com humanos

Abstract: The intensified training (Overtraining - OT), resulting from an increase in the frequency of daily workouts with the consequent decrease in the rest period between sessions can produce two differentiated states related to performance: a state of maintenance or even slight increase...

Abstract: The intensified training (Overtraining - OT), resulting from an increase in the frequency of daily workouts with the consequent decrease in the rest period between sessions can produce two differentiated states related to performance: a state of maintenance or even slight increase (functional overreaching - FOR) or a state of loss of previously acquired conditioning (non-functional overreaching - NFOR). Previous studies from our research group suggest that mitochondrial dynamics is in the genesis of both processes. The objective of this work was to analyze the possible existence of a pro-apoptotic signal in the red gastrocnemius muscle of animals classified as NFOR in comparison with the group classified as FOR after an OT protocol. Our hypothesis is that the pro-apoptotic signaling induced by an increased oxidative stress levels would explain the reduced basal autophagic flow observed previously in muscle of NFOR animals. This dissertation is divided in 2 chapters. In Chapter 1 we present the results referring to proteins related to the autophagic and apoptotic process (LC3 I and LC3 II, JNK, p53, caspase-3) induced by reactive oxygen species in FOR and NFOR animals. The OT protocol was conducted in scientific collaboration with the Laboratory of Physiology of Equines and Pharmacology (UNESP-Jaboticabal). The protocol originally proposed (Hohl et al.,2009) predicted a 60h rest after the exhaustion test for the analysis of samples from both groups of animals. However, in this work the muscle samples were collected immediately after the exhaustion test and frozen in liquid nitrogen. Thus, the results presented here do not represent only the chronic response to the OT protocol, being contaminated with the acute effects of the incremental exhaustion test. This conclusion can be evidenced by the absence of differences in the citrate synthase activities and LC3II/I ratio in the FOR and NFOR groups. We observed a pro-apoptotic signaling coming from the mitochondria in NFOR animals, which presented reduction of the mitochondrial pró-caspase-3 content with concomitant increase of its fragment in the cytosol associated with higher levels of cytosolic prócaspase-3. This alteration may represent the cleavage of caspase-3 in mitochondria and its translocation to the cytosol, a mechanism associated with mitochondrial apoptotic signaling. We also observed higher levels of p53 in the cytosolic fraction of the NFOR group. The cytosolic localization of these proteins may interfere with the synthesis of autophagosomes, since the synergistic action between p53 and caspase-3 can inhibit autophagic machinery proteins, evidenced by the lowest LC3II/I ratio in the NFOR. Such interference could reduce the capacity of mitochondria degradation, increasing the content of dysfunctional mitochondria and decrease in performance in the NFOR group. In Chapter 2 we present the standardization of a subcellular fractionation protocol of small amounts of frozen samples of skeletal muscle tissue. Tissue freezing causes structural alterations in cells, inducing disruption of cell membranes and organelles, being mitochondria very sensitive to this condition. Western blot analyses of cytosolic (alpha-tubulin), mitochondrial (VDAC1) and nuclear (histone H3) fractions in association with citrate synthase activity in mitochondrial fraction indicated that the modifications introduced in the protocol associated with the care reported during the homogenization of frozen samples allowed to produce subcellular fractions with a reasonable degree of purity of small amounts (50mg) of skeletal muscle and with greater retention of the soluble content of the mitochondrial fraction. The possibility of using small amounts of tissues enabled the analyses presented in Chapter 1, of the distribution of proteins related to proapoptotic signaling in the cytosolic, mitochondrial and nuclear fractions without important contaminations among these fractions. In addition, it allows the fractionation of samples from biopsies, facilitating the planning of experiments with human beings

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