Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: A anemia falciforme (AF) resulta da homozigose de uma mutação de ponta no gene HBB, resultando na produção da cadeia ß-globina alterada (ßS). A doença é caracterizada por anemia hemolítica crônica, crises dolorosas de vaso-oclusão, lesões de órgãos-alvo e um estado inflamatório crônico....

Resumo: A anemia falciforme (AF) resulta da homozigose de uma mutação de ponta no gene HBB, resultando na produção da cadeia ß-globina alterada (ßS). A doença é caracterizada por anemia hemolítica crônica, crises dolorosas de vaso-oclusão, lesões de órgãos-alvo e um estado inflamatório crônico. Pacientes com AF apresentam contagens elevadas de leucócitos, e evidências indicam a participação dos leucócitos no início e propagação dos processos vaso-oclusivos, pois estas células são relativamente grandes e rígidas, fazendo com que seu recrutamento para a microcirculação reduza o fluxo sanguíneo nos vasos. O papel das plaquetas no processo vaso-oclusivo é pouco conhecido, apesar de sabermos que há ativação das plaquetas na AF. Sendo assim, este projeto teve como principal objetivo avaliar o papel das plaquetas no processo vaso-oclusivo, estimulado pela citocina TNF, em camundongos quimeras para AF, visualizando e diferenciando as células participantes deste processo inflamatório. Adicionalmente, o efeito da depleção ou diminuição da atividade das plaquetas na resposta inflamatória causada por TNF em camundongos com AF foi verificado. No decorrer deste projeto, realizamos as técnicas de transplante de medula óssea de camundongos transgênicos Berkeley para camundongos C56BL/6 (com o intuito de produzir camundongos quimeras por AF e aumentar a colônia de animais com AF), além de microscopia convencional intravital e microscopia intravital confocal da microcirculação do musculo cremaster com marcação fluorescente para plaquetas e leucócitos. Nós verificamos que, após estímulo dos animais AF com TNF, a plaqueta atua como primeiro sinal da resposta inflamatória, possuindo a função de recobrir o endotélio inflamado da microcirculação e então recrutando leucócitos (com ambos, alta e baixa expressão da molécula Ly6G), tanto em animais controles como em animais AF. Além disso, em associação ao aumento da adesão de plaquetas a parede vascular, houve uma redução da velocidade do fluxo sanguíneo destes animais e da sua sobrevida. Verificamos que tratamentos capazes de diminuir a quantidade de plaquetas ou a ativação plaquetária (uso de anticorpo anti-CD42b e prasugrel, respectivamente) foram capazes de reduzir, ou até reverter, o recrutamento de plaquetas e leucócitos na microcirculação e, portanto, os processos vaso-oclusivos em camundongos AF. A administração de hidroxiureia em animais AF reduziu o recrutamento das plaquetas e dos leucócitos e a formação de agregados plaquetas/ leucócitos na microcirculação, melhorando a velocidade de fluxo nos mesmos. Finalmente, comparamos o mecanismo de vaso-oclusão, estimulado por processos de hipóxia e reperfusão, com a vaso-oclusão induzida por TNF; apesar de um maior recrutamento de leucócitos na microcirculação destes camundongos AF, verificamos um menor recrutamento das plaquetas com menor diminuição do fluxo sanguíneo. Esses dados nos levam a concluir que a plaqueta possui um papel importante nos processos inflamatórios induzidos por TNF, iniciando e propagando os processos vaso-oclusivos em animais com AF. Apesar dos dados decepcionantes do primeiro ensaio clinico multicêntrico com prasugrel na AF, agentes antiplaquetários ainda devem ser estudados como forma de terapia em combinação, ou não, com a hidroxiureia para diminuir a frequência das crises vaso-oclusivas ou até para uso em pacientes hospitalizados por este motivo

Abstract: Sickle cell anemia (SCA) results from a homozygotic mutation in the HBB gene, resulting in the production of the altered ß-globin (ßS) chain. The disease is characterized by chronic hemolytic anemia, painful vaso-occlusive crises, target organ damage and a chronic inflammatory state....

Abstract: Sickle cell anemia (SCA) results from a homozygotic mutation in the HBB gene, resulting in the production of the altered ß-globin (ßS) chain. The disease is characterized by chronic hemolytic anemia, painful vaso-occlusive crises, target organ damage and a chronic inflammatory state. Patients with SCA have high leukocyte counts, and evidence indicates the participation of leukocytes in the triggering and propagation of vaso-occlusive processes, as these cells are relatively large and rigid, causing their recruitment to blood vessel walls in the microcirculation and reducing blood flow. The role of platelets in the vaso-occlusive process is poorly understood, although we know that platelet activation occurs in SCA. Thus, this project aimed to evaluate the role of platelets in vaso-occlusive processes, stimulated by TNF cytokine, in chimeric mice with SCA, visualizing and differentiating the cells participating in this inflammatory process. Additionally, the effect of the depletion of platelets or the inhibition of their activity on the inflammatory response caused by TNF in mice with SCA was evaluated. For this project, we produced chimeric SCA mice by transplanting the bone marrow of SCA Berkeley transgenic mice into C56BL/6 mice (in order to increase the SCA mouse colony size), in addition to conventional intravital microscopy and intravital confocal microscopy of the cremaster muscle microcirculation, with fluorescent labeling for platelets and leukocytes. We found that, after stimulation of SCA animals with TNF, the platelets act as a primary response signal, covering the inflamed endothelium of microcirculation and subsequently recruiting leukocytes (with both high and low expressions of the Ly6G adhesion molecule), both in Control (CON) and SCA animals. Moreover, in association with increased platelet adhesion to the vascular wall, there was a reduction in blood flow velocity and animal survival. We found that treatments capable of decreasing platelet count or platelet activation (use of anti-CD42b antibody or prasugrel, respectively) were able to reduce, or even reverse, the recruitment of platelets and leukocytes in the microcirculation, and thus vaso-occlusive processes in SCA mice. Administration of hydroxyurea in SCA animals reduced platelet and leukocyte recruitment and the formation of platelet / leukocyte aggregates in the microcirculation, therefore improving blood flow rate. Finally, we compared the mechanism of vaso-occlusion, when stimulated by hypoxia and reperfusion processes, with TNF-induced vaso-occlusion in SCA mice; despite an increased recruitment of leukocytes in the microcirculation of the SCA mice subjected to hypoxia/reperfusion, we observed less platelet recruitment with a less significant decrease in blood flow. These data lead us to conclude that the platelet plays an important role in TNF-induced inflammatory processes, initiating and propagating vaso-occlusive mechanisms in animals with SCA. Despite the disappointing data from the first multicenter clinical trial of prasugrel in SCA, antiplatelet agents should still be studied as a form of therapy for the disease, in combination or not with hydroxyurea, to decrease the frequency of vaso-occlusive episodes or even for use in patients hospitalized for acute vaso-occlusive crisis

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