Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A coordenação motora envolve processos neurais específicos que vão desde a percepção de seu estímulo até a realização da resposta, sendo dependente da integração sensório-motora, que é particularmente evidente na medula espinal. Sendo assim, lesões nas raízes medulares podem resultar em...

Resumo: A coordenação motora envolve processos neurais específicos que vão desde a percepção de seu estímulo até a realização da resposta, sendo dependente da integração sensório-motora, que é particularmente evidente na medula espinal. Sendo assim, lesões nas raízes medulares podem resultar em perdas sensitivas e motoras, dependendo da raiz afetada, o que as torna um importante problema médico. A reparação de tais lesões é uma tarefa delicada, devido à possibilidade de novos danos à medula espinal e de estruturas circunvizinhas, bem como a possibilidade de gerar dor neuropática. Desse modo, os procedimentos cirúrgicos de restauração de lesões nas raízes priorizam o reparo das raízes ventrais (componente motor), em relação ao componente sensorial (raizes dorsais). Nesse contexto, um tratamento inédito que propomos é a utilização de gel de plasma rico em plaquetas (PRP) humano, como alternativa para o reparo de raízes dorsais lesadas. Além disso, tendo em vista que a terapia celular é outra ferramenta promissora que poderia fornecer melhorias regenerativas ao local lesionado, o presente trabalho investigou os beneficios provocados pelas células-tronco embrionárias humanas (hESC) associando-as ao gel de PRP. As células em questão foram modificadas geneticamente para superexpressar o fator de crescimento de fibroblasto-2 (FGF-2; isoforma 18 kDa). Adicionalmente, também propomos a utilização de nanofibras de ácido poli L-ácido láctico (PLLA) a fim de fornecer um suporte mecânico para estabilização das raízes dorsais reparadas e utilizadas como um controle negativo. Portanto, para investigar a eficácia do gel PRP, como elemento adesivo e indutivo de regeneração axonal, bem como os benefícios das hESC modificadas, ratos Lewis fêmeas com 8 semanas de idade, foram submetidos à rizotomia dorsal unilateral (L4-L6), onde as raízes foram reparadas utilizando-se PRP, associado ou não à terapia celular (N=5; por grupo experimental). O gel de plasma rico em plaquetas (PRP) foi obtido a partir de sangue humano e caracterizado em relação à concentração, integridade e viabilidade das plaquetas. Já as células humanas foram caracterizadas, fenotipadas por citometria de fluxo e processadas para avaliar a expressão dos transcritos gênicos BDNF, GDNF, FGF-2, IGF e VEGFA, por qRT-PCR in vitro. A recuperação do arco reflexo foi avaliada semanalmente pelo método eletrônico von-Frey, durante oito semanas. As medulas espinais foram processadas para avaliar a expressão gênica (TNFa, TGFb, BDNF, GDNF, FGF2, VEGF, NGF, IL4, IL6, IL13), por qRT-PCR in vivo, 1 semana após a lesão, e alterações tanto nos circuitos sinápticos glutamatérgicos (anti-VGLUT1) como na resposta glial (anti-GFAP e anti-Iba-1) foram avaliadas por imunofluorescência, uma (fase aguda) e oito semanas (fase crônica) após a lesão. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicam que o plasma rico em plaquetas (PRP) ativado, utilizado para o reparo das raízes medulares foi eficiente, possibilitando a reconexão física da raiz seccionada à superfície medular, de forma a permitir reinervação sensorial no ambiente medular. Desse modo, a abordagem cirúrgica ora utilizada contribuiu para a regeneração nervosa, visto pela restauração da rede sináptica (glutamatérgica) e a não exacerbação da atividade glial (que pode ter facilitado a penetração de axônios em regeneração) nas lâminas medulares analisadas, bem como pelos resultados positivos nos testes funcionais. Além disso, o reparo das raízes com PRP apresentou efeitos imunomodulatórios, sendo que este também serviu como arcabouço para as células tronco embrionárias humanas (hESC). A terapia celular, por sua vez, não trouxe melhora adicional em termos funcionais, apesar da significativa expressão de fatores tróficos in vitro. Em conclusão, o presente estudo indica a viabilidade de reparo de raízes medulares dorsais, restaurando parcialmente a integração de inputs sensitivos e motores, com importante ganho funcional

Abstract: Motor coordination involves specific neural processes ranging from the perception of stimuli to the motor response, being dependent on the sensorimotor integration, which is particularly important in the spinal cord. In this sense, spinal cord injuries can result in sensory and motor...

Abstract: Motor coordination involves specific neural processes ranging from the perception of stimuli to the motor response, being dependent on the sensorimotor integration, which is particularly important in the spinal cord. In this sense, spinal cord injuries can result in sensory and motor losses depending on the affected root, becoming an important medical problem. The repair of such lesions is challenging, because of the risk of additional damage to the spinal cord and surrounding structures, as well as the possibility of generating neuropathic pain. Thus, surgical procedures for restoration of root lesions prioritize the repair of the ventral roots (motor component) over the sensory component (dorsal roots). In this context, we propose a new treatment using human platelet-rich plasma (PRP) gel for the repair of injured dorsal roots. Further, in view of stem cell therapy as a promising tool to improve regeneration, the present work investigated the benefits of human embryonic stem cells (hESC) in association with PRP following root lesion. Such cells have been bioengineered for inducible overexpression fibroblast growth factor-2 (FGF2). We also propose the use of poly L-lactic acid (PLLA) nanofibers to provide mechanical support for repaired dorsal roots, as a negative control. Therefore, to investigate the efficacy of PRP gel as an adhesive and inductive element of axonal regeneration, as well as the benefits of modified hESC, 8-week-old female Lewis rats underwent unilateral dorsal rhizotomy (L4-L6), where the roots were repaired using PRP, associated or not with cell therapy (N = 5; per experimental group). PRP was obtained from human blood and characterized regarding platelet concentration, integrity, and viability. The human cells were characterized, phenotyped by flow cytometry and processed to evaluate the expression of gene transcripts for BDNF, GDNF, FGF-2, IGF and VEGFA, by qRT-PCR. The reflex arc recovery was evaluated weekly through the electronic von-Frey method, for eight weeks. The spinal cords were processed to evaluate the in vivo expression of gene transcripts for TNFa, TGFb, BDNF, GDNF, FGF2, VEGF, NGF, IL4, IL6 and IL13 by qRT-PCR, 1-week post-lesion. Also, changes in the glutamatergic synaptic circuits (anti-VGLUT1) and glial reactions (anti-GFAP e anti-Iba-1) were evaluated by immunofluorescence, 1-week (acute phase) and 8-weeks (chronic phase) post-lesion. Taken together, the results of the present study indicate that the activated platelet rich plasma (PRP) used to repair the dorsal spinal roots was efficient, allowing the physical reconnection of the sectioned root to the spinal surface and the sensory reinnervation in the spinal environment. Thus, the surgical approach used herein contributed to axon regeneration, as seen by the partial restoration of the glutamatergic synaptic network. This happened without exacerbation of glial reactivity, producing behavioral improvement overtime. In addition, root repair with PRP showed immunomodulatory effects. Also, PRP served as a scaffold for human embryonic stem cells (hESC). Cell therapy did not bring additional improvement in functional terms, despite the significant expression of trophic factors in vitro. In conclusion, the present study indicates the feasibility of repairing dorsal spinal roots, partially restoring the integration of sensory and motor inputs, with important functional gain

Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDF