Estudos funcionais de sequências terminadoras de genes induzidos por déficit hídrico em raízes de cana-de-açúcar (Saccharum spp.)
Willian de Souza Bernardes
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP B456e
[Functional studies of terminators sequences of genes induced by water deficit in sugarcane roots (Saccharum spp.)]
Campinas, SP : [s.n.], 2019.
1 recurso online (72 p.) : il., digital, arquivo PDF.
Orientador: Marcelo Menossi Teixeira
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Terminadores transcricionais são sequências de ácidos nucleicos não codificantes responsáveis por regular a expressão gênica em eucariotos. Apesar do seu potencial em aumentar a expressão de transgenes, pouca atenção tem sido dada a esses elementos regulatórios. Nosso grupo identificou cinco...
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Resumo: Terminadores transcricionais são sequências de ácidos nucleicos não codificantes responsáveis por regular a expressão gênica em eucariotos. Apesar do seu potencial em aumentar a expressão de transgenes, pouca atenção tem sido dada a esses elementos regulatórios. Nosso grupo identificou cinco terminadores transcricionais a partir de genes presentes no genoma de cana-de-açúcar. Quatro desses terminadores são provenientes de genes induzidos por déficit hídrico, como o gene homólogo à Deidrina 1 (ScDHN), Precursor Rico em Prolina (ScPRP), RNA longo não codificante (ScLNC) e o gene da Proteína Intrínseca ao Tonoplasto 2-3 (ScTIP2-3). Um quinto terminador foi isolado a partir do gene constitutivo da ubiquitina (Ubi). A sequência de DNA de cada terminador foi clonada à jusante da região codificante do gene repórter da beta-glucoronidase (gusA), sob o controle do promotor da ubiquitina de milho (ZmUbi) em vetor binário pORE T1. Uma construção com o terminador NOS do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefaciens foi usada como controle positivo e uma construção sem terminador usada como controle negativo. Para validar a atividade dos terminadores, calos de cana-de-açúcar foram transformados com as construções por meio da técnica de biobalística para a expressão transiente de GUS. O ensaio histoquímico de GUS demonstrou que todos os cinco terminadores de cana-de-açúcar são capazes de regular a expressão gênica e o ensaio fluorimétrico indicou que os terminadores de cana-de-açúcar permitem maior expressão gênica do que o tNOS. Os calos transformados com o controle negativo não apresentaram expressão de GUS. Além disso, exposição a estresse hídrico de calos transformados com a construção do terminador tScTIP2-3, resultou em um aumento nos níveis de expressão de GUS. É provável que comportamento similar seja apresentado pelos terminadores tScDHN, tScLNC e ScPRP se expostos a estresse hídrico, uma vez que todos os quatro provém de genes induzidos por déficit hídrico. Esses resultados demonstram que os cinco terminadores de cana-de-açúcar possuem potencial para aplicações em biotecnologia molecular, sobretudo como ferramenta molecular na geração de plantas resistentes a estresse hídrico
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Abstract: Transcriptional terminators are non-coding nucleic acid sequences responsible for regulating gene expression in eukaryotes. Despite their potential to increase transgene expression, little attention has been paid to these regulatory elements. Our group identified five transcriptional...
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Abstract: Transcriptional terminators are non-coding nucleic acid sequences responsible for regulating gene expression in eukaryotes. Despite their potential to increase transgene expression, little attention has been paid to these regulatory elements. Our group identified five transcriptional terminators from genes present in the sugarcane genome. Four of these terminators come from water deficit-induced genes, such as the Dehydrin-1 homologous gene (ScDHN), Proline Rich Precursor (ScPRP), Non-coding Long RNA (ScLNC), and the Tonoplast Intrinsic Protein 2-3 gene (ScTIP2-3). A fifth terminator was isolated from the ubiquitin constitutive gene (Ubi). The DNA sequence of each terminator was cloned downstream of the coding region of the beta-glucuronidase reporter gene (gusA) under the control of the maize ubiquitin promoter (ZmUbi) in pORE T1 binary vector. A NOS terminator construct of the Agrobacterium tumefaciens nopaline synthase gene was used as a positive control and a terminatorless construct used as a negative control. To validate the activity of the terminators, sugarcane corns were transformed with the constructs by the biobalistic technique for GUS transient expression. The GUS histochemical assay showed that all five sugarcane terminators are capable of regulating gene expression and the fluorimetric assay indicated that sugarcane terminators allow higher gene expression than tNOS. Calluses transformed with negative control showed no GUS expression. In addition, exposure to water stress from transformed callus with the construction of the tScTIP2-3 terminator resulted in an increase in GUS expression levels. Similar behavior is likely to be exhibited by the tScDHN, tScLNC and ScPRP terminators if exposed to water stress, since all four come from water deficit-induced genes. These results show that the five sugarcane terminators have potential for applications in molecular biotechnology, especially as a molecular tool in the generation of plants resistant to water stress
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Estudos funcionais de sequências terminadoras de genes induzidos por déficit hídrico em raízes de cana-de-açúcar (Saccharum spp.)
Willian de Souza Bernardes
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