Orientadores: Íscia Teresinha Lopes Cendes, Fabio Rossi Torres

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: As epilepsias constituem um dos grupos de doenças neurológicas graves que afetam de 1,5 - 2% da população mundial. Diversos tipos de malformações do desenvolvimento cortical (MDC) estão frequentemente associados à ocorrência de crises refratárias, incluindo a Displasia Cortical Focal (DCF)...

Resumo: As epilepsias constituem um dos grupos de doenças neurológicas graves que afetam de 1,5 - 2% da população mundial. Diversos tipos de malformações do desenvolvimento cortical (MDC) estão frequentemente associados à ocorrência de crises refratárias, incluindo a Displasia Cortical Focal (DCF) que se caracteriza por alterações citoarquiteturais também observadas em outras MDC, como a Esclerose Tuberosa (ET) e a Hemimegaencefalia (HME). Uma forte associação entre ET, HME e mutações em mosaicismo tem sido demonstrada, e a identificação desse tipo de mutação pode contribuir para o entendimento dessas doenças. Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi investigar variantes genéticas relacionadas à etiologia das DCF. Para tal, foi utilizado como estratégia o Deep Sequencing por NGS. Sequenciamos o DNA genômico de tecido cerebral proveniente de ressecção cirúrgica e do sangue periférico de pacientes com DCF. Realizamos o sequenciamento de um painel customizado de genes da via mTOR/GATOR e validamos com a técnica de PCR digital. Encontramos duas variantes em mosaico no tecido cerebral, localizadas no gene MTOR (p.Leu1460Pro e p.Ala1459Pro) em dois pacientes distintos e não aparentados com DCF do tipo IIb, correspondendo a 16,6% dos pacientes testados (2/12). A porcentagem de mosaicismo no tecido cerebral foi de 0,75% e 3,98% respectivamente nos dois pacientes. Além disso, para compararmos o perfil genético da DCF com outra MDC, realizamos o sequenciamento do mesmo painel customizado em DNA extraído do sangue de 24 pacientes com o diagnóstico clínico de ET, e encontramos mutações germinativas nos genes TSC1 e TSC2 em 54,5% dos pacientes analisados (12/22), e uma variante potencialmente patogênica no gene IRS1 em um único paciente. Completamos nosso estudo dos pacientes com DCF pesquisado também alterações cromossômicas estruturais (CNVs), utilizamos array cromossômico de citogenética molecular e validamos por qPCR. Encontramos com potencial patogênico uma CNV com deleção envolvendo o gene NOTCH2 no mesmo paciente que encontramos mutação em mosaico no gene MTOR, podendo se tratar de um caso de segundo-evento mutacional. Desse modo concluímos que 16.6% dos pacientes com DCF apresenta mutações em mosaico no tecido cerebral em genes da via mTOR/GATOR. Assim especulamos que se mutações em mosaico são realmente uma causa frequente de DCF é possível que exista o acometimento de outras vias, além da via mTOR/GATOR investigada nesse trabalho. Encontramos mutações germinativas predominantemente nos genes TSC1 e TSC2 na maioria dos pacientes com ET, o que indicaria uma etiologia genética nesses pacientes fundamentalmente diferente daquela encontrada nos pacientes com DCF. Ao encontramos alterações estruturais cromossômicas em um paciente com DCF, mostramos a importância da investigação desse tipo de mutação nesses pacientes. Desse modo, concluímos que nosso trabalho contribuiu para um melhor entendimento da etiologia genética das DCFs

Abstract: Epilepsies constitute one of the groups of serious neurological diseases that affect 1.5 - 2% of the world population. Several types of malformations of cortical development (MDC) are frequently associated with the occurrence of refractory crises, including Focal Cortical Dysplasia (FCD)...

Abstract: Epilepsies constitute one of the groups of serious neurological diseases that affect 1.5 - 2% of the world population. Several types of malformations of cortical development (MDC) are frequently associated with the occurrence of refractory crises, including Focal Cortical Dysplasia (FCD) which is characterized by cytoarchitectural changes also observed in other MDC, such as Tuberous Sclerosis (TS) and Hemimegaencephaly (HME). A strong association between TS, HME and mosaicism mutations has been demonstrated, and the identification of this type of mutation can contribute to the understanding of these diseases. Therefore, the main goal of this work was to investigate genetic variants related to the etiology of FCD. To this end, Deep Sequencing by NGS was used as a strategy. We sequenced genomic DNA from brain tissue from surgical resection and from peripheral blood of patients with FCD. We performed the sequencing of a customized panel of genes from the mTOR/GATOR pathway and validated it with the digital PCR technique. We found two mosaic variants in brain tissue, located in the MTOR gene (p.Leu1460Pro and p..Ala1459Pro) in two distinct and unrelated patients with FCD type IIb, corresponding to 16.6% of the patients tested (2/12). The percentage of mosaicism in brain tissue was 0.75% and 3.98% respectively in the two patients. Furthermore, to compare the genetic profile of FCD with another MDC, we performed sequencing of the same customized panel on DNA extracted from the blood of 24 patients with the clinical diagnosis of TS, and we found germline mutations in the TSC1 and TSC2 genes in 54.5% of the analyzed patients (12/22), and a potentially pathogenic variant in the IRS1 gene in a single patient. We completed our study of patients with FCD, also researched structural chromosomal alterations (CNVs), used a chromosomal array of molecular cytogenetics and validated by qPCR. We found a CNV with a deletion involving the NOTCH2 gene with pathogenic potential in the same patient that we found a mosaic mutation in the MTOR gene, it may be a case of a two-hit event. Thus, we conclude that 16.6% of patients with FCD have mosaic mutations in brain tissue in genes of the mTOR/GATOR pathway. Thus, we speculate that if mosaic mutations are indeed a frequent cause of FCD, it is possible that other pathways are involved, in addition to the mTOR/GATOR pathway investigated in this work. We found germline mutations predominantly in the TSC1 and TSC2 genes in most patients with TS, which would indicate a genetic etiology in these patients fundamentally different from that found in patients with FCD. When we found chromosomal structural alterations in a patient with FCD, we showed the importance of investigating this type of mutation in these patients. Thus, we conclude that our work contributed to a better understanding of the genetic etiology of FCDs

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