Modification of cell surface proteins by protein trans-splicing using the Npu DnaE Intein

Abstract

Oberflächenproteine stellen ein Forschungs- und Entwicklungsgebiet von anhaltendem Interesse dar. Dies lässt sich auf die Tatsache zurückgeführten, dass zusätzlich zu dem dynamischen Verhalten der Plasmamembran, die das Verhalten und die Eigenschaften von Proteinen beeinflusst, Zelloberflächenproteine in wichtige zelluläre Vorgänge involviert sind. Zu diesen zählen u.a. die Signaltransduktion, Immunantwort, Zelladhäsion und Zellkommunikation. Zur Aufklärung von Stuktur und Funktion von Oberflächenproteinen wurden in jüngster Zeit einige Markierungsstrategien entwickelt. In Verbindung mit der Technik der Fluoreszenzmikroskopie stellen diese Strategien ein leistungsstarkes Werkzeug zur Erforschung von Membranproteinen dar. Gespaltene Inteine haben sich in den Gebieten der Biochemie und Molekularbiologie als effizient Werkzueg zur Manipulation von Proteinen etabliert, was anhand ihrer vielfältigen biotechnologischen Anwendungen ersichtlich wird. In diesen Fällen werden entweder die artifiziell im Labor erzeugten oder natürlich vorkommenden gespaltenen Inteine als separate Fusionsgene exprimiert und anschließend die Proteinspleißreaktion in trans durchgeführt. Dieser autokatalytische Vorgang des Protein-trans-Spleißens (PTS) erfordert zunächst die Assoziation der Inteinhälften und die Bildung des aktiven Komplexes. Anschließend werden während der Entfernung der Inteinhälften die flankierenden Exteinsequenzen in einer nativen Peptidbindung miteinander verknüpft. In Bezug auf Löslichkeit und Faltung der Inteinfusionsproteine besitzen natürlich gespaltene Inteine einige Vorteile, da sie sich zur PTS-Reaktion von gespaltenen Proteinen evolviert haben. In dieser Arbeit wurde des natürlich gespaltene DnaE-Intein aus Nostoc punctiforme erfolgreich zur Markierung von Oberflächenproteinen verwendet. Die ausgezeichneten Spleißeigenschaften dieses Inteins machen es zu einem idealen Kandidaten für diesen Zweck. Unter Verwendung von Konfokalmikroskopie und Western Blot Analyse konnte gezeigt werden, dass die mit nicht-nativen Exteinen fusionierten Inteinhälften exprimierten und auch effizient auf der extrazellulären Oberfläche von Säugerzellen markiert werden konnten. Bei physiologischer Temperatur von 37 °C und in serumfreiem Zellkulturmedium lief die PTS-Reaktion auf der Öberfläche von lebenden Zellen innerhalb von Minuten ab. Dabei war die Reaktion weder von der Anwesenheit reduzierender Agenzien noch von der Wahl des Membranankers (Transmembrandomäne oder GPI) abhängig. Allerdings wurden sie einerseits von der Art der auf der Zelloberfläche exprimierten Inteinhälfte beeinflusst und andererseits von der Länge der Linkerregion zwischen Inteinhälfte und Transmembrandomänenanker. Des Weiteren nahmen die verwendeten Exteinsequenzen eine besondere Rolle in der Spleißreaktion auf der Zelloberfläche ein. Aufgrund der durchgeführten Studien konnten die entwickelte Strategie als eine schnelle und effiziente Methode zur Markierung von Oberflächenproteinen etabliert werden. Es ist davon auszugehen, dass diese bei der Manipulation von Membranproteinen und zur Herstellung von GPI-verankerten Proteinen vorteilhaft sein wird. In einem weitern Teil der Arbeit wurde versucht Zelloberflächenproteine mit Hilfe der PCP-Domäne zu markieren. Weiterhin erfolgten Experimente zum Protein trans-Spleißen auf der Oberfläche von Quantum dots um beliebige Proteine von Interesse zu markieren.