Mammary stem cells (MaSCs) are a model to understand molecular processes that regulate both normal and cancer development. In contrast to many organs, the mammary gland undergoes cycles of re-generation and involution associated with pregnancy. For this reason, the mammary gland was one of the first organs in which stem cells (SCs) were hypothesized to reside. From the concept that SCs regulate normal mammary gland growth and differentiation with onset of pregnancy, arose the hypothesis that cancer cells with SC properties may contribute to tumor heterogeneity. To understand how normal development of the mammary gland architecture arises from SCs and the role of CSCs in tumor progression, the function of the IFITM3 gene was investigated in this thesis research. IFITM3 was initially identified by Zucchi’s lab in LA7 cells, rat mammary SCs that differentiate into domes, 2D structures similar to alveoli that form in mammary gland at pregnancy. It was demonstrated by the Zucchi group that the function of IFITM3 was dependent on its shuttling from the cytoplasm to the plasma membrane and being part of lipid rafts. This was the starting point of the thesis research with the aims to identify whether IFITM3 also plays a role in the formation of more complex three dimensional (3D) mammary structures (tubule-alveolar structures) and has a role in MaSCs. I used transient and stable IFITM3 expression modulating systems in the LA7 and the human MCF7 mammary cell line. In contrast to the rat LA7 SCs that have both the capacity to generate spheres and differentiate morphologically and functionally into all the mammary cell types and generate tubule-alveolar structures iin 3D culture conditions, the MCF7 clone used in this study are not considered to have SC properties, do not form spheres and can only form one type of 3D differentiated structure called cysts. Targeting IFITM3 in these cells, with siRNA/oligos and short hairpin RNA lentiviral technology in order to down-regulate the expression of the protein, and by performing functional assays in 3D culture conditions, I found that IFITM3 is necessary for the formation of complex alveolar structures in MCF7 cells and for self-renewal of LA7 SCs. As mammary spheres and mammary cysts represent different 3D structures associated with stem and differentiated cells respectively, and since IFITM3 down-regulation inhibits the formation of both, this suggests that IFITM3 may have different functions depending on the cell type. Down-regulation of IFITM3 in LA7 SCs in both adherent or in non-adherent cultures resulted in a gradual loss in the number of cells, suggesting that IFITM3 function is necessary for self-renewal of LA7 SCs. In contrast down regulation of IFITM3 in MCF7 cells resulted in the inability of the cells to form alveoli with no effect in cell proliferation. IFITM3 up-regulation in both LA7 and MCF7 cells resulted in rapid cell death by a mechanism that is still under investigation. Collectively, I demonstrate, that IFITM3 down-regulation results in loss of self-renewal and loss of the ability of LA7 to be propagated as SCs. While IFITM3 down-regulation in mammary cells that do not IV have SC self-renewal capacity results in the inability of the cells to generate 3D structures. Microarray expression experiments, obtained with down-regulation of IFITM3 in LA7 cells, support the IFITM3 function in cell cycle regulation, vesicular transport and in the modification of the chromatin state. In addition to genes involved in cell proliferation found down-regulated with loss of IFITM3, a link among vesicle-transport genes (involving proteins mediating vesicle fusion, such as SNARE), and IFITM3 was also determined, supporting a role of IFITM3 in preventing the release of viral particles from endosomal compartments, associated with membrane fusion and the formation of a fusion pore. Genes associated with epigenomic regulation and cell proliferation suggests that IFITM3 may have multiple and different roles in SCs and in differentiated mammary cells since these genes are involved in cancer, cell growth or apoptosis and in cell differentiation.

Le cellule staminali della ghiandola mammaria sono un modello per lo studio dei processi molecolari che regolano lo sviluppo fisiologico dell’organo e lo sviluppo tumorale. Diversamente da molti organi, la ghiandola mammaria incorre in cicli di rigenerazione e involuzione associati alla gravidanza. Per questo la ghiandola mammaria è uno dei primi organi nel quale si è ipotizzata la residenza di cellule staminali. Dal concetto che le cellule staminali regolano la crescita e la differenziazione della ghiandola con l’avvento della gravidanza è stato ipotizzato che cellule tumorali con proprietà staminali possano contribuire all’eterogeneità del tumore. Al fine di scoprire come il normale sviluppo dell’architettura della ghiandola mammaria sia originata dalle cellule staminali e il ruolo delle cellule staminali tumorali nella progressione tumorale, in questo lavoro di tesi è stata indagata la funzione di IFITM3. IFITM3 è stato inizialmente identificato dal laboratorio della dott.ssa Zucchi nelle cellule LA7, cellule staminali della ghiandola mammaria di ratto capaci di differenziare in dome, strutture 2D simili agli alveoli che si formano nella ghiandola mammaria durante la gravidanza. È stato dimostrato dal gruppo Zucchi che la funzione di IFITM3 dipende dal cambio di localizzazione della proteina dal citoplasma alla membrana plasmatica, dove risiede nei lipid raft. Questo è stato il punto di partenza di questa tesi di ricerca con lo scopo di identificare se IFITM3 partecipi anche alla formazione di strutture tridimensionali complesse della ghiandola mammaria (strutture tubulo-alveolari) e se svolga una funzione nel mantenimento delle cellule staminali della ghiandola mammaria. Ho utilizzato sistemi transienti e stabili per la modulazione dei livelli di espressione di IFITM3 in cellule LA7 e in cellule MCF7, una linea cellulare umana di ghiandola mammaria. Mentre le cellule LA7 possiedono sia la capacità di generare sfere sia di differenziare morfologicamente e funzionalmente in tutti i tipi cellulari e strutture 3D della ghiandola mammaria, si ritiene che cloni MCF7 utilizzati in questo studio non possiedano proprietà di cellule staminali, non formano sfere e possono differenziare unicamente in un tipo di struttura 3D, le cisti simili agli alveoli della ghiandola mammaria. Abbattendo i livelli di espressione di IFITM3 con siRNA/oligo e tecnologia lenti virale ad RNA a forcina corta (shRNA) in cellule impiegate in saggi funzionali in condizioni di coltura 3D, ho scoperto che IFITM3 è necessario per la formazione di strutture tubulo-alveolari complesse in cellule MCF7 e per il mantenimento delle proprietà di auto-rinnovamento delle cellule staminali LA7. Dato che le mammosfere e le cisti mammarie rappresentano strutture 3D associate rispettivamente a cellule staminali o differenziate, e dato che la sotto-regolazione di IFITM3 inibisce la formazione di entrambe, possiamo ipotizzare che IFITM3 abbia una funzione diversa in base al tipo cellulare. La sotto-regolazione di IFITM3 in cellule staminali LA7 in condizioni di coltura aderenti e non aderenti ha portato ad una graduale perdita delle cellule, suggerendo che IFITM3 svolga una funzione necessaria al mantenimento dell’auto-rinnovamento delle cellule staminali LA7. In cellule MCF7 la sotto-regolazione di IFITM3 ha portato all’incapacità delle cellule di formare alveoli senza effetti sulla proliferazione cellulare. La sovra-regolazione di IFITM3 sia in cellule LA7 sia MCF7 ha portato alla rapida morte cellulare per un meccanismo che è ancora sotto indagine. Complessivamente ho dimostrato che la sotto-regolazione di IFITM3 porta alla perdita delle proprietà di auto-rinnovamento II e della capacità di essere propagate come cellule staminali delle cellule LA7. La sotto-regolazione di IFITM3 in cellule che non hanno proprietà staminali di auto-rinnovamento porta all’incapacità delle cellule di formare strutture 3D. Lo studio dei profili di espressione genica con tecnologia micorarray ottenuti da cellule LA7 trattate per la sotto-regolazione di IFITM3 supporta il ruolo di IFITM3 nella regolazione del ciclo cellulare, nel trasporto vescicolare e nella modificazione dello stato cromatinico. Geni coinvolti nella proliferazione cellulare sono stati trovati sotto-regolati in seguito alla perdita di IFITM3, insieme a geni del trasporto vescicolare (che coinvolgono proteine che mediano la fusione vescicolare, come le SNARE) che possono essere collegati a IFITM3 in quanto il ruolo di IFITM3 nel prevenire il rilascio delle particelle virali dai compartimenti endosomiali è associato alla formazione di un poro di fusione e alla fusione delle membrane. I geni associati con la regolazione epigenomica e la proliferazione cellulare suggeriscono che IFITM3 possa avere differenti ruoli in cellule staminali e cellule della ghiandola mammaria differenziate, dato che questi geni sono coinvolti nel cancro, nella crescita cellulare o apoptosi e nel differenziamento cellulare.

THE ROLE OF IFITM3 IN MAMMARY GLAND DEVELOPMENT AND MAMMARY STEM CELLS / S. Molgora ; tutore: C. Battaglia ; co-tutore: I. Zucchi ; direttore del dottorato: M. Clerici. DIPARTIMENTO DI BIOTECNOLOGIE MEDICHE E MEDICINA TRASLAZIONALE, 2015 Dec 17. 28. ciclo, Anno Accademico 2015. [10.13130/molgora-stefano_phd2015-12-17].

THE ROLE OF IFITM3 IN MAMMARY GLAND DEVELOPMENT AND MAMMARY STEM CELLS

S. Molgora
2015

Abstract

Mammary stem cells (MaSCs) are a model to understand molecular processes that regulate both normal and cancer development. In contrast to many organs, the mammary gland undergoes cycles of re-generation and involution associated with pregnancy. For this reason, the mammary gland was one of the first organs in which stem cells (SCs) were hypothesized to reside. From the concept that SCs regulate normal mammary gland growth and differentiation with onset of pregnancy, arose the hypothesis that cancer cells with SC properties may contribute to tumor heterogeneity. To understand how normal development of the mammary gland architecture arises from SCs and the role of CSCs in tumor progression, the function of the IFITM3 gene was investigated in this thesis research. IFITM3 was initially identified by Zucchi’s lab in LA7 cells, rat mammary SCs that differentiate into domes, 2D structures similar to alveoli that form in mammary gland at pregnancy. It was demonstrated by the Zucchi group that the function of IFITM3 was dependent on its shuttling from the cytoplasm to the plasma membrane and being part of lipid rafts. This was the starting point of the thesis research with the aims to identify whether IFITM3 also plays a role in the formation of more complex three dimensional (3D) mammary structures (tubule-alveolar structures) and has a role in MaSCs. I used transient and stable IFITM3 expression modulating systems in the LA7 and the human MCF7 mammary cell line. In contrast to the rat LA7 SCs that have both the capacity to generate spheres and differentiate morphologically and functionally into all the mammary cell types and generate tubule-alveolar structures iin 3D culture conditions, the MCF7 clone used in this study are not considered to have SC properties, do not form spheres and can only form one type of 3D differentiated structure called cysts. Targeting IFITM3 in these cells, with siRNA/oligos and short hairpin RNA lentiviral technology in order to down-regulate the expression of the protein, and by performing functional assays in 3D culture conditions, I found that IFITM3 is necessary for the formation of complex alveolar structures in MCF7 cells and for self-renewal of LA7 SCs. As mammary spheres and mammary cysts represent different 3D structures associated with stem and differentiated cells respectively, and since IFITM3 down-regulation inhibits the formation of both, this suggests that IFITM3 may have different functions depending on the cell type. Down-regulation of IFITM3 in LA7 SCs in both adherent or in non-adherent cultures resulted in a gradual loss in the number of cells, suggesting that IFITM3 function is necessary for self-renewal of LA7 SCs. In contrast down regulation of IFITM3 in MCF7 cells resulted in the inability of the cells to form alveoli with no effect in cell proliferation. IFITM3 up-regulation in both LA7 and MCF7 cells resulted in rapid cell death by a mechanism that is still under investigation. Collectively, I demonstrate, that IFITM3 down-regulation results in loss of self-renewal and loss of the ability of LA7 to be propagated as SCs. While IFITM3 down-regulation in mammary cells that do not IV have SC self-renewal capacity results in the inability of the cells to generate 3D structures. Microarray expression experiments, obtained with down-regulation of IFITM3 in LA7 cells, support the IFITM3 function in cell cycle regulation, vesicular transport and in the modification of the chromatin state. In addition to genes involved in cell proliferation found down-regulated with loss of IFITM3, a link among vesicle-transport genes (involving proteins mediating vesicle fusion, such as SNARE), and IFITM3 was also determined, supporting a role of IFITM3 in preventing the release of viral particles from endosomal compartments, associated with membrane fusion and the formation of a fusion pore. Genes associated with epigenomic regulation and cell proliferation suggests that IFITM3 may have multiple and different roles in SCs and in differentiated mammary cells since these genes are involved in cancer, cell growth or apoptosis and in cell differentiation.
17-dic-2015
Le cellule staminali della ghiandola mammaria sono un modello per lo studio dei processi molecolari che regolano lo sviluppo fisiologico dell’organo e lo sviluppo tumorale. Diversamente da molti organi, la ghiandola mammaria incorre in cicli di rigenerazione e involuzione associati alla gravidanza. Per questo la ghiandola mammaria è uno dei primi organi nel quale si è ipotizzata la residenza di cellule staminali. Dal concetto che le cellule staminali regolano la crescita e la differenziazione della ghiandola con l’avvento della gravidanza è stato ipotizzato che cellule tumorali con proprietà staminali possano contribuire all’eterogeneità del tumore. Al fine di scoprire come il normale sviluppo dell’architettura della ghiandola mammaria sia originata dalle cellule staminali e il ruolo delle cellule staminali tumorali nella progressione tumorale, in questo lavoro di tesi è stata indagata la funzione di IFITM3. IFITM3 è stato inizialmente identificato dal laboratorio della dott.ssa Zucchi nelle cellule LA7, cellule staminali della ghiandola mammaria di ratto capaci di differenziare in dome, strutture 2D simili agli alveoli che si formano nella ghiandola mammaria durante la gravidanza. È stato dimostrato dal gruppo Zucchi che la funzione di IFITM3 dipende dal cambio di localizzazione della proteina dal citoplasma alla membrana plasmatica, dove risiede nei lipid raft. Questo è stato il punto di partenza di questa tesi di ricerca con lo scopo di identificare se IFITM3 partecipi anche alla formazione di strutture tridimensionali complesse della ghiandola mammaria (strutture tubulo-alveolari) e se svolga una funzione nel mantenimento delle cellule staminali della ghiandola mammaria. Ho utilizzato sistemi transienti e stabili per la modulazione dei livelli di espressione di IFITM3 in cellule LA7 e in cellule MCF7, una linea cellulare umana di ghiandola mammaria. Mentre le cellule LA7 possiedono sia la capacità di generare sfere sia di differenziare morfologicamente e funzionalmente in tutti i tipi cellulari e strutture 3D della ghiandola mammaria, si ritiene che cloni MCF7 utilizzati in questo studio non possiedano proprietà di cellule staminali, non formano sfere e possono differenziare unicamente in un tipo di struttura 3D, le cisti simili agli alveoli della ghiandola mammaria. Abbattendo i livelli di espressione di IFITM3 con siRNA/oligo e tecnologia lenti virale ad RNA a forcina corta (shRNA) in cellule impiegate in saggi funzionali in condizioni di coltura 3D, ho scoperto che IFITM3 è necessario per la formazione di strutture tubulo-alveolari complesse in cellule MCF7 e per il mantenimento delle proprietà di auto-rinnovamento delle cellule staminali LA7. Dato che le mammosfere e le cisti mammarie rappresentano strutture 3D associate rispettivamente a cellule staminali o differenziate, e dato che la sotto-regolazione di IFITM3 inibisce la formazione di entrambe, possiamo ipotizzare che IFITM3 abbia una funzione diversa in base al tipo cellulare. La sotto-regolazione di IFITM3 in cellule staminali LA7 in condizioni di coltura aderenti e non aderenti ha portato ad una graduale perdita delle cellule, suggerendo che IFITM3 svolga una funzione necessaria al mantenimento dell’auto-rinnovamento delle cellule staminali LA7. In cellule MCF7 la sotto-regolazione di IFITM3 ha portato all’incapacità delle cellule di formare alveoli senza effetti sulla proliferazione cellulare. La sovra-regolazione di IFITM3 sia in cellule LA7 sia MCF7 ha portato alla rapida morte cellulare per un meccanismo che è ancora sotto indagine. Complessivamente ho dimostrato che la sotto-regolazione di IFITM3 porta alla perdita delle proprietà di auto-rinnovamento II e della capacità di essere propagate come cellule staminali delle cellule LA7. La sotto-regolazione di IFITM3 in cellule che non hanno proprietà staminali di auto-rinnovamento porta all’incapacità delle cellule di formare strutture 3D. Lo studio dei profili di espressione genica con tecnologia micorarray ottenuti da cellule LA7 trattate per la sotto-regolazione di IFITM3 supporta il ruolo di IFITM3 nella regolazione del ciclo cellulare, nel trasporto vescicolare e nella modificazione dello stato cromatinico. Geni coinvolti nella proliferazione cellulare sono stati trovati sotto-regolati in seguito alla perdita di IFITM3, insieme a geni del trasporto vescicolare (che coinvolgono proteine che mediano la fusione vescicolare, come le SNARE) che possono essere collegati a IFITM3 in quanto il ruolo di IFITM3 nel prevenire il rilascio delle particelle virali dai compartimenti endosomiali è associato alla formazione di un poro di fusione e alla fusione delle membrane. I geni associati con la regolazione epigenomica e la proliferazione cellulare suggeriscono che IFITM3 possa avere differenti ruoli in cellule staminali e cellule della ghiandola mammaria differenziate, dato che questi geni sono coinvolti nel cancro, nella crescita cellulare o apoptosi e nel differenziamento cellulare.
Settore BIO/11 - Biologia Molecolare
BATTAGLIA, CRISTINA
Doctoral Thesis
THE ROLE OF IFITM3 IN MAMMARY GLAND DEVELOPMENT AND MAMMARY STEM CELLS / S. Molgora ; tutore: C. Battaglia ; co-tutore: I. Zucchi ; direttore del dottorato: M. Clerici. DIPARTIMENTO DI BIOTECNOLOGIE MEDICHE E MEDICINA TRASLAZIONALE, 2015 Dec 17. 28. ciclo, Anno Accademico 2015. [10.13130/molgora-stefano_phd2015-12-17].
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