Estudio de los cambios funcionales, anatómicos y moleculares en el sistema nervioso central en respuesta a distintos tipos de trasplante de células madre

Abstract

INTRODUCCIÓN La retina, parte del SNC, ofrece una ventana de fácil acceso al estudio de la degeneración neuronal. El aplastamiento del nervio óptico (ApNO), es un modelo de degeneración de CGR bien estudiado en roedores. Las terapias de neuroprotección intentan prevenir o retrasar los procesos neurodegenerativos. Sin embargo, las terapias celulares no están teniendo las altas tasas de éxito como se esperaba. OBJETIVOS Los objetivos generales de esta tesis son: 1. Evaluar el uso de los tejidos perinatales en oftalmología mediante búsqueda bibliográfica de modelos preclínicos. 2. Estudiar el efecto de las células MO-CEM en cuatro tipos trasplantes sobre la funcionalidad y arquitectura de la retina sana. 3. Evaluar la importancia del tipo de trasplante en el efecto neuroprotector y neurorregenerativo de las MO-CEM. 4. Estudiar la capacidad neuroprotectora de las vesículas derivadas de MO-CEM tras el ApNO en trasplante singénico. 5. Analizar el efecto neurotóxico y neuroprotector del clon TEG3 en la retina sana y tras el aplastamiento del nervio óptico. 6. Evaluar diferencias en la expresión génica de células de microglía. MATERIAL Y MÉTODOS En los experimentos de esta tesis se utilizaron ratones de las cepas: C57/BL6 pigmentados, BALB/c albinos, y transgénicos C57BL/6-Tg(CAG-EGFP). También se utilizaron ratas de la cepa Sprague Dawley (SD). Las células elegidas para los experimentos fueron las células estromales mesenquimales procedentes de médula ósea (MO-CEM) murinas y humanas, y la línea inmortalizada de glía envolvente olfatoria TEG3. La degeneración de CGR se indujo mediante ApNO a 0,5 mm del globo ocular. La inyección de células y vehículo se realizó mediante inyección intravítrea. El suministro de minociclina se realizó mediante inyección intraperitoneal al igual que la dexametasona que se combinó con ciclosporina A oral en el agua. Se realizaron experimentos in vivo para mediante SD-OCT y de la función mediante ERG. Se realizaron estudios moleculares de expresión génica mediante PCRc y cuantificación de citoquinas mediante ensayos de inmunoabsorción (ELISA) y scRNA secuenciación. También se realizaron experimentos de inmunofluorescencia en retinas tanto a corte como a plano. La cuantificación de CGR se realizó de manera automática y se estudió su distribución mediante mapas de isodensidad y/o mapas de vecinos. Se realizó una búsqueda bibliográfica sistemática sobre el uso de tejidos perinatales (PnD) en modelos preclínicos en oftalmología. Los análisis estadísticos se realizaron en el programa GraphPad® Prism v6. Las diferencias se consideraron significativas cuando p valor < 0,05. RESULTADOS En la revisión bibliográfica sobre el uso de PnD observamos que la mayoría de estudios usaban la hMA como tejido completo para tratar defectos corneales. En el estudio del trasplante singénico, alogénico y xenotrasplante de MO-CEM en la retina no lesionada vimos que el xenotrasplante es el más agresivo disminuyendo la funcionalidad del tejido y alterando la estructura. En cuanto a la neuroprotección de las MO-CEM, el trasplante singénico era el único capaz de proteger significativamente de la muerte a las dos subpoblaciones de CGR, y el número de axones regenerados fue mayor. La inyección intravítrea de vesículas extracelulares derivadas de MO-CEM murinas demostró mejores efectos neuroprotectores que las propias células a los 5 días tras ApNO. En el estudio de la inyección intravítrea del clon TEG3 observamos que activa a las células de microglía y causa una pérdida de CGR a los 21 días, aunque neuroprotege de la muerte tras ApNO a los 7 días. En el estudio de la expresión génica de las células de microglía xenotrasplantadas vimos que en esta respuesta inmunitaria participan 12 grupos de células activas (microglía/macrófagos).

CONCLUSIONES Existe una falta de homogeneidad en los estudios preclínicos de PnD en oftalmología. El tipo de trasplante de MO-CEM afecta la estructura y funcionalidad de la retina sana. Las vesículas extracelulares derivadas de MO-CEM mejoran las propiedades neuroprotectoras de las MO-CEM. El trasplante de células TEG3 produce una reducción de la población de CGR y una neuroprotección tras ApNO en alogenia. El xenotrasplante de MO-CEM en retinas intactas activa la vía de respuesta inmune adaptativa.

INTRODUCTION The retina, part of the CNS, offers an easily accessible window into the study of neuronal degeneration. Optic nerve crush (ONC) is a well-studied rodent model of RGC degeneration. Neuroprotective therapies attempt to prevent or delay neurodegenerative processes. However, cell therapies are not having the high success rates as expected. OBJECTIVES The general objectives of this thesis are: 1. To evaluate the use of perinatal tissues in ophthalmology by means of a bibliographic search of preclinical models. 2. To study the effect of BM-MSC cells in four types of transplants on the functionality and architecture of the healthy retina. 3. To evaluate the importance of the type of transplantation on the neuroprotective and neuroregenerative effect of BM-MSC. 4. To study the neuroprotective capacity of BM-MSC-derived vesicles after ONC in syngeneic transplantation. 5. To analyse the neurotoxic and neuroprotective effect of the TEG3 clone in healthy retina and after optic nerve crushing. 6. To evaluate differences in gene expression in microglia cells. MATERIAL AND METHODS In the experiments of this thesis, C57/BL6 pigmented, BALB/c albino, and C57BL/6-Tg(CAG-EGFP) transgenic mice were used. Sprague Dawley (SD) rats were also used. The cells chosen for the experiments were murine and human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) and the immortalised olfactory ensheathing glia line TEG3. RGC degeneration was induced by ONC at 0.5 mm from the eyeball. Injection of cells and vehicle was performed by intravitreal injection. Minocycline was delivered by intraperitoneal injection as was dexamethasone which was combined with oral cyclosporine A in water. In vivo experiments were performed for SD-OCT and function by ERG. Molecular studies of gene expression by qPCR and quantification of cytokines by immunosorbent assays (ELISA) and scRNA sequencing were performed. Immunofluorescence experiments were also performed on both slice and flat retinas. RGC quantification was performed automatically and their distribution was studied using isodensity maps and/or neighbour maps. A systematic literature search on the use of perinatal tissues (PnD) in preclinical models in ophthalmology was performed. Statistical analyses were performed in GraphPad® Prism v6. Differences were considered significant when p-value < 0.05. RESULTS In the literature review on the use of PnD we observed that most studies used hAM as whole tissue to treat corneal defects. In the study of syngeneic, allogeneic and xenotransplantation of hAM-MSC in the uninjured retina, we found that xenotransplantation is the most aggressive, decreasing the functionality of the tissue and altering the structure. Regarding the neuroprotection of BM-MSCs, syngeneic transplantation was the only one able to significantly protect both RGC subpopulations from death, and the number of regenerated axons was higher. Intravitreal injection of murine BM-MSC-derived extracellular vesicles showed better neuroprotective effects than the cells themselves at 5 days after ONC. In the study of intravitreal injection of the TEG3 clone, we observed that it activates microglia cells and causes a loss of RGCs at 21 days, but neuroprotects against death after ONC at 7 days. In the study of gene expression in xenotransplanted microglia cells, we found that 12 active cell groups (microglia/macrophages) are involved in this immune response. CONCLUSIONS There is a lack of homogeneity in preclinical studies of PnD in ophthalmology. The type of BM-MSC transplantation affects the structure and functionality of the healthy retina. Extracellular vesicles derived from BM-MSCs enhance the neuroprotective properties of BM-MSCs. Transplantation of TEG3 cells results in a reduction of the RGC population and neuroprotection after ONC in allogeneic. BM-MSC xenotransplantation into intact retinas activates the adaptive immune response pathway.