Regulatory role of calmodulin on systems relevant in tumor cells signaling

Abstract

[EN]: Calmodulin (CaM) phosphorylated at different serine/threonine and tyrosine residues is known to exert differential regulatory effects on different CaM-binding proteins as compared to non-phosphorylated CaM. In this work we describe the preparation and characterization of a series of phospho-(Y)-mimetic CaM mutants in which either one or the two tyrosine residues present in CaM (Y99 and Y138) were substituted to aspartic acid or glutamic acid. We demonstrated some biological properties of these CaM mutants, such as their differential phosphorylation by the tyrosine kinase c-Src, and their action as compared to wild type CaM, on the activity of two CaM-dependent enzymes: cyclic nucleotide phosphodiesterase 1 (PDE1), and endothelial nitric oxide synthase (eNOS), as well as c-Src and the epidermal growth factor receptor (EGFR). We demonstrated that CaM directly interacts with c-Src in both Ca2+-dependent and Ca2+-independent manners in vitro, and that in living cells the CaM antagonist W-7 inhibits this kinase induced by the upstream activation of EGFR, in human carcinoma epidermoide A431 cells, and by hydrogen peroxide-induced oxidative stress, in both A431 cells and human breast adenocarcinoma SK-BR-3 cells. Most relevant and for the first time, we demonstrated that Ca2+-free CaM (apo-CaM) exerts a far higher activatory action than Ca2+/CaM on Src auto-phosphorylation. We also present experimental evidences suggesting that the EGFR from A431 and A549 cells is subjected to O-GlcNAcylation, and that CaM may be involved in the regulation of this process through binding to the O-GlcNAc transferase (OGT). We detected a positive O-GlcNAcylation signal in immunoprecipitated EGFR using immunoblot and two distinct specific anti-O-GlcNAc antibodies. Conversely, the presence of EGFR was detected by immunoblot among the O-GlcNAcylated proteins immunoprecipitated with an anti-O-GlcNAc antibody. These signals were enhanced when a highly specific O-linked β-N-acetylglucosaminidase (OGA) inhibitor was present. Most significantly, we detected a positive O-GlcNAcylation signal in immunoprecipitated and N-deglycosylated EGFR using peptide-N-glycosidase F (PNGase F), and from tunicamycin-treated cells when were metabolically labeled with GlcNAz. We also performed O-GlcNAcylation assay in vitro using immunoprecipitated EGFR and OGT, which resulted in the enhancement of the EGFR O-GlcNAcylation signal. We concluded that the EGFR from A431 and A549 tumor cells is subjected to O-GlcNAcylation. Furthermore, we present preliminary data using in silico studies, combined with binding assays such as Ca2+-dependent CaM-affinity chromatography and co-immunoprecipitation experiments, showing that OGT is a putative CaM-binding protein.

[ES]: La calmodulina (CaM) fosforilada en diferentes residuos de serina/treonina y tirosina ejerce efectos reguladores diferenciales en una diversidad de proteínas de unión a CaM en comparación con CaM no fosforilada. En esta Tesis se describe la preparación y caracterización de una serie de mutantes fosfo-(Y)-miméticos de la CaM en el que uno o los dos residuos de tirosina presentes en la CaM (Y99 y Y138) fueron sustituidos por ácido aspártico o ácido glutámico. Hemos demostrado algunas propiedades biológicas de estos mutantes de la CaM, tales como su fosforilación diferencial por la tirosina quinasa c-Src y su acción, en comparación con CaM tipo salvaje, sobre la actividad de varios enzimas CaM-dependientes: la fosfodiesterasa de nucleótidos cíclicos 1 (PDE1), la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS), c-Src y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Hemos demostrado que la CaM interactúa directamente con Src de forma dependiente e independiente de Ca2+ in vitro, y que en células vivas el antagonista de CaM W-7 inhibe esta quinasa inducida por la activación aguas arriba del EGFR, en células A431 de carcinoma epidermoide human, y por estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno, tanto en células A431 como en células de adenocarcinoma de mama humano SK-BR-3. De mayor relevencia y por primera vez, hemos demostrado que la CaM libre de Ca2+ (apo-CaM) ejerce una acción activadora mucho mayor que el complejo Ca2+/CaM sobre la auto-fosforilación de Src. También presentamos evidencias experimentales que sugieren que el EGFR de células A431 yA549 está sometido a O-GlcNAcylatión, y que la CaM puede estar implicada en la regulación de este proceso mediante su unión a la O-GlcNAc transferasa (OGT). Hemos detectado una señal positiva de O-GlcNAcylación en el EGFR inmunoprecipitado usando inmunoblot y dos anticuerpos específicos anti-O-GlcNAc distintos. Adicionalmente, la presencia de EGFR se detectó por inmunoblot entre las proteínas O-GlcNAcyladas e inmnoprecipitadas con un anticuerpo anti-O-GlcNAc. Estas señales se incrementaron cuando un inhibidor altamente específico de la O-ligado β-N-acetilglucosaminidasa (OGA) estuvo presente. Más significativamente, se detectó una señal de O-GlcNAcylación positiva en el EGFR inmunoprecipitado y N-deglicosilado usando péptido-N-glicosidasa F (PNGasa F), y a partir de células tratadas con tunicamicina cuando se marcaron metabólicamente con azido-GlcNAc. También se realizaron ensayos de O-GlcNAcylación in vitro utilizando EGFR y OGT inmunoprecipitados, lo que resultó en el incremento de la señal de O-GlcNAcylación en el EGFR. Llegamos a la conclusión de que el EGFR de las células tumorales A431 y A549 están sometidos a O-GlcNAcylación. Además, se presentan datos preliminares de estudios in silico, así como ensayos experimentales de unión, tales como cromatografía de afinidad de CaM dependiente de Ca2+ y co-inmunoprecupitación, demostrando que la enzima OGT es putativamente una proteína de unión a CaM.