Insights into the copper resistance in Staphylococcus aureus

Abstract

Copper is an important trace element for organisms as it is a cofactor of several enzymes responsible by diverse biological processes. However, its intracellular concentration needs to be controlled, otherwise it can cause oxidative damage and threat cell survival. In this work the main objectives were to study the growth profiles and copper resistance of four Staphylococcus aureus strains with different genetic backgrounds at different copper concentration and perform the biochemical characterization of the multicopper oxidase from S. aureus. The study of the copper resistance in S. aureus showed that the presence of copBmco operon originates a higher strain fitness when copper is present in the growth media. Furthermore, its localization within a plasmid was observed to provide higher copper resistance than if it is chromosomally located. It was also show that copL, which encodes a surface-exposed Cu-binding lipoprotein, may contributes to the overall copper resistance. Regarding the biochemical characterization of the multicopper oxidase, the heterologous protein was produced in E. coli and isolated by cation exchange chromatography with a yield of 13 mg/L. The enzyme produced was isolated without copper ions bound to the polypeptide chain and was able to oxidize 2,6- dimetoxifenol, presenting an optimal activity at pH values between 5.0 and 7.0 and being dependent on the presence of exogenously added copper ions. To reconstitute the copper sites the enzyme was incubated with an multicopper oxidase:Cu ratio of 1:4 for 1 hour on ice, that reconstituted 4 copper ions per protein. The multicopper oxidase native enzymatic activity was also evaluated through an in situ assay, and all S. aureus strains that contained the mco gene were able to oxidize syringaldazine. The knowledge acquired will allow a better understanding of copper resistance mechanisms in S. aureus and the development of strategies to combat bacteria with high copper resistance.

O cobre é um oligoelemento importante para os organismos sendo um cofator para várias enzimas envolvidas em diversos processos biológicos. No entanto, a sua concentração intracelular precisa de ser controlada senão pode causar danos oxidativos ameaçando a sobrevivência da célula. Neste trabalho os principais objetivos foram estudar o crescimento e a resistência ao cobre de quatro estirpes de Staphylococcus aureus, com diferentes patrimónios genéticos, em diferentes concentrações de cobre e realizar a caracterização bioquímica da enzima multicopper oxidase de S. aureus. O estudo da resistência ao cobre demonstrou que a presença do operão copBmco origina um aumento de fitness quando existe cobre no meio e que a sua localização num plasmídeo fornece maior resistência do que quando localizado no cromossoma. Também foi demonstrado que o copL, que codifica uma lipoproteína que se liga ao cobre, contribuí para a resistência ao cobre. Na caracterização bioquímica da multicopper oxidase, a proteína heteróloga foi produzida em E. coli e isolada por cromatografia de troca catiónica com um rendimento de 13 mg/L. A enzima produzida, isolada sem iões de cobre ligados à cadeia polipeptídica, demonstrou capacidade de oxidar o 2,6-dimetoxifenol na presença de cobre exógeno apresentando um pH ótimo de atividade entre 5.0 e 7.0. Para preencher os seus centros de cobre, a enzima foi incubada em gelo numa proporção de multicopper oxidase:Cu de 1:4 por 1 hora o que reconstituiu 4 átomos de cobre por proteína. A atividade enzimática nativa da multicopper oxidase foi também avaliada através de um ensaio de atividade in situ onde todas as estirpes de S. aureus contendo o gene mco foram capazes de oxidar o syringaldazine. Os conhecimentos adquiridos neste trabalho vão permitir uma maior compreensão do mecanismo de resistência ao cobre em S. aureus e o desenvolvimento de estratégias para combater bactérias com elevada resistência ao cobre.