Aplicação de métodos moleculares ao diagnóstico de Giardia lamblia e de Entamoeba spp.

Abstract

Entamoeba histolytica e Giardia lamblia são protozoários com distribuição mundial que frequentemente infectam o Homem, sendo causadores de elevada morbilidade associada com quadros de diarreia. Este estudo consistiu na utilização de métodos moleculares na detecção e identificação destes parasitas em amostras de fezes recebidas no Laboratório de Patologia Tropical do Instituto de Higiene e Medicina Tropical (Lisboa, Portugal), no período decorrente entre Setembro de 2007 e Agosto de 2009. . Foi igualmente avaliada a eficácia e custo-benefício de um método alternativo de conservação para material biológico fecal – o papel de filtro, para subsequente extracção de DNA. Foram analisadas microscopicamente 80 amostras, 23,8 % (19/80) das quais positivas para Giardia e 27,5% (22/80) positivas para Entamoeba spp.. Através do método molecular da PCR, amplificou-se com sucesso DNA de Giardia para o gene ssurRNA em 94,7% (18/19) das amostras microscopicamente positivas. No que se refere às amostras positivas por exame microscópico para Entamoeba spp foi detectada E. dispar em 50,0% (11/22) das amostras após amplificação de parte do gene 16S rRNA. Adicionalmente foi também detectado DNA de E. histolytica em 20,0% (4/20) das amostras analisadas, microscopicamente negativas para Entamoeba spp.. Neste estudo realizou-se a genotipagem de G. lamblia utilizando parte dos genes bg (beta-giardina), tpi (triose-fosfato isomerase) e gdh (glutamato desidrogenase), que revelou haver 61,5% (8/13) dos isolados pertencentes ao genótipo B e 38,5% (5/13) do genótipo A. A determinação de subgenótipos através da análise de SNP’s para os 3 genes só foi possível para o gene bg do genótipo A, revelando 3 amostras correspondentes ao subgenótipo A2 e uma para o subgenótipo A3. Para os restantes genes não foi possível a determinação de subgenótipos devido à presença de polimorfismos genéticos para ambos os genótipos A e B. Realizou-se também a análise filogenética concatenada que apenas permitiu a integração de três amostras identificadas com o genótipo A no subgenótipo AII. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a microscopia associada às técnicas moleculares possibilita a diferenciação das espécies do complexo Entamoeba favorecendo o correcto diagnóstico desta patologia e consequente tratamento. Para além disso, o uso dos métodos moleculares contribuiu para o esclarecimento e compreensão dos genótipos de Giardia em humanos. Neste estudo a utilização do método de conservação, papel de filtro apresentou um menor custo e elevada eficácia em relação aos métodos normalmente utilizados, conservação a -20ºC. Sugerindo a sua utilização com sucesso em estudos epidemiológicos em especial em zonas endémicas de condições precárias.

Entamoeba histolytica and Giardia lamblia are two protozoa that are worldwide distributed commonly infecting men and causing elevated morbidity associated with diarrheal disease. In this study we used molecular techniques to detect and identify these parasites in the fecal samples received in the Pathology Laboratory of the Institute of Tropical Medicine and Hygiene (Lisbon, Portugal) in the period of September 2007 and August 2009. We equally evaluated the efficiency and cost-effectiveness of the stool sample conservation method – FTA filter paper and subsequent DNA extraction. A total of 80 samples were examined by microscopy. The protozoan parasite Giardia lamblia was detected in 23,8 % (19/80) of the isolates and Entamoeba spp. in 27,5% (22/80). G.lamblia and E.dispar were detected by PCR in 94,7% (18/19) and 50,0% (11/22) of the microscopy positive isolates, respectively. Additionally it was detected DNA of E.histolytica in 20,0% (4/20) of the samples microscopically negative for Entamoeba spp. Genotyping of G. lamblia for the genes β–giardin (bg), triose phosphate isomerase (tpi) and glutamate dehydrogenase (gdh) has shown that genotype B (61.5% - 8/13) was more prevalent that genotype A (38,5% - 5/13). A Single Nucleotide Polymorphism’s (SNP) analysis for the three genes of Giardia was conducted in order to assess the subassemblage level of the tested samples. However we were only able to determine the subassemblage level for samples of bg gene belonging to genotype A, where three samples corresponded to subassemblage A2 and one to subassemlage A3. In the remaining genes, due to the high genetic polymorphisms for both genotypes A and B the subassemblage level was not possible to determine. Phylogenetic concatenated analysis was also carried out allowing the association of three samples with subassemblage AII. The results of our study show that the microscopy in combination with molecular techniques allow the differentiation of Entamoeba species favoring the correct diagnosis and subsequent treatment of this disease. In addition, the use of molecular methods contributed to the clarification and understanding of the genotypes of Giardia infections in humans. In this study, the use of the FTA filter paper preservation method showed a lower cost and high effectiveness when compared to the commonly used methods, (storage at -20 ° C), suggesting that it can be successfully I epidemiological studies used in endemic areas with poor laboratory conditions.