Characterization of genes from a genomic Signature for sporulation in the human Gastrointestinal tract

Abstract

RESUMO: Cerca de 50-60% das bactérias do trato gastrointestinal humano são anaeróbicas e capazes de diferenciar esporos. Os esporos possibilitam a persistência dos organismos no ambiente, bem como a sua transmissão entre hospedeiros. Em espécies patogénicas, como é o caso de Clostridioides difficile, o esporo é fundamental para a disseminação, persistência, colonização e infeção. Recentemente foi identificada uma assinatura genómica da esporulação no intestino que contém 66 genes presentes na maioria dos organismos esporulantes. A função de cerca de um terço dos genes da assinatura não é ainda conhecida. Neste trabalho, examinámos o padrão de expressão de quatro genes da assinatura e foi estabelecida a sua dependência relativamente aos quatro fatores sigma da esporulação, usando C. difficile como modelo. Três destes genes mostraram expressão específicamente nas células em esporulação: a expressão de dois é confinada ao pré-esporo e é controlada pelo fator sigma precoce sF; um outro é específico da célula mãe sendo controlado pelo fator tardio sK. Foi iniciada a caracterização fenotípica de um mutante de eliminação em fase do gene CD22730, obtido utilizando um sistema CRISPR/Cas9. A eliminação deste gene resulta num aumento da esporulação mas os esporos formados mostram contudo uma reduzida resistência ao calor, sugerindo o envolvimento de CD22730 na biogénese do córtex do esporo. Os esporos do mutante apresentam ainda uma forte redução na espessura do manto/exósporo e uma abundância de CdeM, uma proteína essencial para a montagem do exósporo e de um apêndice polar do esporo. Assim, CD22730 parece também envolvida na formação do manto/exósporo. Os nossos resultados abrem caminho para um estudo da função do gene CD22730 em modelos animais de colonização e de doença. Para além de aprofundarem o nosso conhecimento da função dos genes da assinatura, estes estudos poderão ainda levar a novas estratégias de controlo do patogéneo C. difficile.

ABSTRACT: About 50-60% of the bacteria in the human intestinal microbiota are anaerobic spore-forming organisms, that produce highly resilient spores. Spores allow the bacteria to persist in a variety of environments and transmission between hosts. For pathogenic spore formers, such as the anaerobe Clostridioides difficile, spores are central to dissemination, persistence, colonization and infection. A genomic signature for sporulation in the gut was recently identified, which contains 66 genes present in most sporulating organisms. Most are involved in spore morphogenesis and germination but about one third have unknown function. Here, we examined the expression pattern of four of the signature genes and established their dependencies on the cell type-specific sigma factors of sporulation, using C. difficile as a model gut organism. Of these, three showed cell-type-specific expression in sporulating cells: two are forespore-specific genes under the control of the early sigma factor sF and one is mother cell-specific, expressed under the control of the late sigma factor sK. We initiated the phenotypic characterization of the CD22730 gene, for which an inframe deletion mutation was obtained using a CRISPR/Cas9 system. The mutation resulted in increased sporulation. The spores of the mutant, however, showed reduced heat resistance, suggesting the involvement of CD22730 in spore cortex biogenesis. These spores were also smaller, with a thinner coat/exosporium layer. The compromised outermost layer, and in particular the reduced abundance of the CdeM protein, a determinant for the assembly of the exosporium and of a spore polar appendage, additionally suggests the involvement of CD22730 in proper assembly of the coat/exosporium. Our results pave the way for studies of the role of CD22730 in animal models of colonization infection, which will improve our understanding of the function of the sporulation signature genes and may also lead to novel strategies to antagonize C. difficile.