Evolution of immune genes in Antarctic fish

Abstract

A superordem dos Notothenioidei inclui o maior número de representantes the peixes ósseos na plataforma continental da Antártida. As condicões abióticas e bióticas que dominam nesta região do mundo levaram à radiação e à especiação desta ordem. As baixas temperaturas que se deram durante o período do Eoceno Tardio levaram à flutuação da superfície ocupada pela calota glaciar no Oceano Antártico o que levou a uma redução do habitat disponível na plataforma continental. Por sua vez, a falta de habitat foi seguida por um declínio nas espécies de peixes ósseos e a uma alteração na relação predador-presa o que permitiu dispersão e diversificação das espécies que se adaptaram ao novo meio ambiente. Há 25 milhões de anos as condições ambientais tornaram-se mais estáveis criando um ambiente dominado por águas frias, ricas em oxygénio e nutrientes o que promoveu a adaptação radiativa dos Notothenoids. Os novos nichos ecológicos associados a condições ambientais estáveis providenciaram aos Notothenoids os requisitos para se tornarem a ordem de peixes ósseos domiante na plataforma continental da Antártida. Um dos pontos de interesse por esta ordem de peixes ósseos deve-se ao facto de ainda não se perceber qual será o impacto do aquecimento global nestas espécies. As diversas adaptações presentes nas várias espécies desta ordem também representam um fator de peso no que leva ao seu interesse científico. Estas vão desde elevada densidade de mitocôndrias e maior dimensão do miocárdio, à perda de resposta das proteínas de choque térmico, perda de hemoglobina, à evolução de proteínas anticongelantes - as adaptações observadas indicam quão bem se deu a adpatação desta ordem a um ambiente extremo. Entretanto, já foram desenvolvidos trabalhos que evidenciam que o sistema imune destas espécies também foi sujeito a adaptações promovidas pelo meio ambiente da Antártida. De modo geral, o sistema imune permite aos organismos superar perturbações que vão ao encontro da sua homeostase. O estudo do sistema imune em vertebrados, como os peixes, pode revelar aspetos importantes para o entendimento da evolução do sistema imune em vertebrados mais complexos. O objetivo deste trabalho é de estudar a evolução de genes que se enquadram no sistema imune de três espécies de peixes ósseos da região Antártida, Eleginops maclovinus que reside na região sub-polar da Antártida e duas espécies cuja a distribuição é limitada ao oceano da Antártida pela corrente circumpolar, Notothenia coriiceps e Dissostichus mawsoni. Para tal, foram escolhidas cinco famílias de genes que se relacionam com o sistema imune, estas foram os toll-like receptors (TLR), immunoglobulin superfamily (IgSf), phosphoinositide-3-kinase (PIK3), AKT/protein kinase B (AKT3) e as semaphorins (Sema). Os genomas e transcriptomas de 8 espécies de peixes foram obtidos de bases de dados de livre acesso enquanto os genomas e transcriptomas das espécies da Antártida foram proporcionados pelo laboratório do Professor LiangBiao Chen da Shanghai Ocean University. Depois de identificadas as sequências proteícas destas famílias no peixe modelo Danio rerio, procedeu-se a uma pesquisa de similaridade por BLAST entre estas últimas e os transcriptomas das restantes espécies de forma a identificar as sequências potencialmente homólogas. Estas sequências por sua vez foram filtradas de modo a somente reter, para cada família, as sequências que apresentavam um rácio de identidade desejado. Após um alinhamento múltiplo de sequências (MSA), foram escolhidos para cada uma das famílias o melhor modelo evolutivo. Com os MSA de amino ácidos foi possível construir para cada família uma árvore filogenética na qual foi possível identificar genes ortólogos. Com os genes ortólogos foi possível construir uma árvore filogenética de espécies. De seguida, os MSA de amino ácidos foram convertidos para alinhamentos de codões para permitir a estimação da taxa de substituição de nucleótidos nas árvores filogenéticas das espécies, que é dada por v= dN/dS onde dN equivale à taxa de substituição não-sinónima e dS a taxa de substituição sinónima. Com o valor de dS foi então possível resolver a equação T=Ks/2r, em que T representa o tempo de divergência a ser calculado, Ks é taxa de substituição sinónima e r é a taxa de substituição estimada obtida da bibliografia. Os resultados relativos ao número de sequências e a análise filogenética permitiram identificar variabilidade no número de genes encontrados em cada espécie tal como também foi possível observar que, quando presentes, os ortólogos das 11 espécies formavam uma árvore filogenética distincta. Estas observações levaram a estipular, tanto para os Notothenoids como para os restantes taxa analisados, que estas famílias de genes se enquadram num processo evolutivo denomiado de processo de nascimento e morte. As estimações dos tempos de divergência, obtidos nos nós para cada família de genes que representada num maior número de espécies resultaram em tempos de divergência similares ou superiores às estimativas dadas pelos registos fósseis. Por sua vez, os nós que apresentavam um menor número de epécies, indicaram tempos de divergência mais recentes do que os registos fósseis. As cinco famílias de genes nos Nototheniidae indicaram tempos de divergência recentes desde 7.1 milhões de anos (m.y.a) para Sema, 6.2 m.y.a para AKT3, 4.3 m.y.a para IgSf, 4 m.y.a para PIK3 e 2.5 m.y.a para TLR. As diferenças obtidas entre os tempos de divergência das cinco famílias de genes revelam uma possível relevância perante a adaptação dos Nototheniidae ao ambiente antártico, pois as famílias de genes que apresentam funções mais diversas também apresentam tempos de divergência mais antigos (Sema, AKT3, PIK3, IgSf) do que as famílias de genes com funções somente immunologicas (TLR). Finalmente, foi possível observar que estes tempos de divergência incluem-se dentro das estimativas cronológicas dadas para um fenómeno climatérico conhecido como transição climatérica do mioceno médio (MMCT) que LiangBiao Chen da Shanghai Ocean University. Depois de identificadas as sequências proteícas destas famílias no peixe modelo Danio rerio, procedeu-se a uma pesquisa de similaridade por BLAST entre estas últimas e os transcriptomas das restantes espécies de forma a identificar as sequências potencialmente homólogas. Estas sequências por sua vez foram filtradas de modo a somente reter, para cada família, as sequências que apresentavam um rácio de identidade desejado. Após um alinhamento múltiplo de sequências (MSA), foram escolhidos para cada uma das famílias o melhor modelo evolutivo. Com os MSA de amino ácidos foi possível construir para cada família uma árvore filogenética na qual foi possível identificar genes ortólogos. Com os genes ortólogos foi possível construir uma árvore filogenética de espécies. De seguida, os MSA de amino ácidos foram convertidos para alinhamentos de codões para permitir a estimação da taxa de substituição de nucleótidos nas árvores filogenéticas das espécies, que é dada por v= dN/dS onde dN equivale à taxa de substituição não-sinónima e dS a taxa de substituição sinónima. Com o valor de dS foi então possível resolver a equação T=Ks/2r, em que T representa o tempo de divergência a ser calculado, Ks é taxa de substituição sinónima e r é a taxa de substituição estimada obtida da bibliografia. Os resultados relativos ao número de sequências e a análise filogenética permitiram identificar variabilidade no número de genes encontrados em cada espécie tal como também foi possível observar que, quando presentes, os ortólogos das 11 espécies formavam uma árvore filogenética distincta. Estas observações levaram a estipular, tanto para os Notothenoids como para os restantes taxa analisados, que estas famílias de genes se enquadram num processo evolutivo denomiado de processo de nascimento e morte. As estimações dos tempos de divergência, obtidos nos nós para cada família de genes que representada num maior número de espécies resultaram em tempos de divergência similares ou superiores às estimativas dadas pelos registos fósseis. Por sua vez, os nós que apresentavam um menor número de espécies, indicaram tempos de divergência mais recentes do que os registos fósseis. As cinco famílias de genes nos Nototheniidae indicaram tempos de divergência recentes desde 7.1 milhões de anos (m.y.a) para Sema, 6.2 m.y.a para AKT3, 4.3 m.y.a para IgSf, 4 m.y.a para PIK3 e 2.5 m.y.a para TLR. As diferenças obtidas entre os tempos de divergência das cinco famílias de genes revelam uma possível relevância perante a adaptação dos Nototheniidae ao ambiente antártico, pois as famílias de genes que apresentam funções mais diversas também apresentam tempos de divergência mais antigos (Sema, AKT3, PIK3, IgSf) do que as famílias de genes com funções somente imunológicas (TLR). Finalmente, foi possível observar que estes tempos de divergência incluem-se dentro das estimativas cronológicas dadas para um fenómeno climatérico conhecido como transição climatérica do mioceno médio (MMCT) que ocorreu entre os 25-5 m.y.a. Esta correlação levou a considerar que as adaptações do sistema imune dos nototheniidae sejam subsequentes ao MMCT.

The Notothenioidei suborder has the largest representation of teleost fish in the Antarctic continental shelf. Their speciation and adaptive radiation was the result of particular abiotic and biotic conditions in the Southern Ocean. During the Late Eocene the cooler temperatures enlarged the ice cover leading to the loss of shelf habitat. This loss of natural environment resulted in a decline of fish diversity followed by the radiation and diversification of those who could adapt to the new conditions. Since then, the stable environment that has governed the Southern Ocean for the last 25 million years promoted the adaption of Notothenoids to cold, oxygen rich waters, allowing them to become the main teleost suborder in the Antarctic shelf habitats. Furthermore, previous work has shown that in Notothenoids immune related genes have undergone adaptations due to their exposure to the environmental conditions of the Antarctic Ocean. Their immune related adaptations give us the opportunity to study the phylogenetic diversification among Notothenioids and other teleosts that adapted to different environments. We studied the evolution of five immune related gene families in eight non- Antarctic vertebrates and three notothenoids, Eleginops maclovinus, Notothenia coriiceps and Dissostichus mawsoni, through phylogenetic analysis and divergence times estimation using nucleic and protein sequences. Genes for five different gene families were obtained from the genome and transcriptome of the investigated species. A possible birth-and-death process may have been identified for the five immune gene families. Furthermore, the divergence times estimated for the nototheniidae indicate that after the Middle Miocene climatic transition, those species relied on the gene families that presented a broader range of functions for their adaption to the Antarctic environment.