Internal browning disorders of 'Rocha' pear during long-term storage

Abstract

A pera 'Rocha' (Pyrus communis L.) é uma cultivar Portuguesa que pode ser armazenada em atmosfera controlada (AC) durante 10 meses. No entanto, sabe-se que é suscetível ao acastanhamento interno (AI), uma das principais causas de perdas económicas durante o armazenamento prolongado. Embora muitos estudos tenham sido realizados para melhor compreender o AI em peras, os mecanismos subjacentes não permanecem por elucidar. O objetivo desta tese é investigar os mecanismos fisiológicos, bioquímicos e moleculares envolvidos no desenvolvimento do AI em pera 'Rocha', estabelecendo a base científica para o desenvolvimento de modelos preditivos para o AI e recomendações de manuseio pós-colheita, visando reduzir a incidência de AI em um ambiente regulatório em que as ferramentas químicas convencionais já não se encontram disponíveis. O AI em pera pode ter vários sintomas e foi demostrado que a suscetibilidade da pera para desenvolver este acidente fisiológico é afetada pela maturação dos frutos à colheita. Neste trabalho, os AIs em pera 'Rocha' foram classificados em duas categorias: decomposição necrótica húmida e cavidades secas, que podem coexistir no mesmo fruto. A ocorrência de cavidades foi associada a períodos de armazenamento mais prolongados e à exposição dos frutos a alto CO2. Os resultados mostraram claramente que as peras colhidas tardiamente eram mais suscetíveis ao AI do que as colhidas num estado de maturação precoce ou ótimo. Para o estudo da base bioquímica do AI foram conduzidos três ensaios em três anos consecutivos. Na nossa primeira avaliação, realizada numa base de longo prazo, a fermentação desempenhou um papel importante no AI, mas o sistema antioxidante não. No entanto, no segundo ensaio, realizado numa base de curto prazo, os resultados sugeriram que o AI em pera 'Rocha' era desencadeado por stress oxidativo. Finalmente, no terceiro ensaio, a base bioquímica do AI relacionado com o CO2 em pera 'Rocha' foi estabelecida. Os resultados mostraram que o mecanismo subjacente ao AI em pera 'Rocha' envolve a conjugação de ambos os metabolismos, antioxidante e fermentativo. A partir dos resultados obtidos um mecanismo o para o desenvolvimento do AI relacionada com o CO2 foi proposto. Neste estudo também se analisou pela primeira vez a regulação molecular de genes que codificam enzimas antioxidantes e fermentativas. As diferenças encontradas na regulação da transcrição destes genes apoiaram os dados bioquímicos. Os resultados também mostraram que o armazenamento dos frutos em alto CO2 leva a uma disfunção do sistema antioxidante e que, quando o alto CO2 é combinado com níveis muito baixos de O2 a fermentação é altamente induzida, com ambos os fatores a atuar sinergicamente no desenvolvimento de IBD. Também trabalhamos para identificar marcadores de predisposição dos frutos para desenvolver AI, o que poderá ser útil para uma avaliação precoce do risco de desenvolvimento de AI. Entre os marcadores bioquímicos, os resultados evidenciaram o acetaldeído, o etanol e o ácido ascórbico como os mais promissores, ao passo que, entre os minerais, o cobre (Cu) era o melhor candidato. Em geral, modelos de previsão do AI em pera 'Rocha' foram desenvolvidos e validados neste trabalho, representando um importante passo na previsão do AI em pera 'Rocha'. De forma a encontrar estratégias de controlo eficazes para prevenir o AI em pera 'Rocha' foram realizados três ensaios em dois anos consecutivos. Dois dos ensaios foram realizados no primeiro ano e o outro no ano seguinte. No primeiro ensaio, atmosferas controladas dinâmicas monitorizadas por fluorescência da clorofila (ACD-FC) e etanol (ACD-EtOH) foram avaliadas para a prevenção do AI. Pela primeira vez mostramos que o armazenamento dos frutos em ACD-FC conduz a uma incidência reduzida de AI, sendo esta uma metodologia promissora para o armazenamento prolongado de pera 'Rocha'. Pelo contrário, mostramos também que o armazenamento em ACD-EtOH poderá não ser adequado para prevenir o AI. No segundo e terceiro ensaios, a eficácia do tratamento com 1-metilciclopropeno (1-MCP) e do armazenamento em atmosfera controlada diferida na prevenção do AI foi avaliada. Pela primeira vez, mostrámos que a eficácia do 1-MCP depende da maturidade dos frutos à colheita e que, quando aplicado em frutos tardios, induz uma maior incidência de AI. Os resultados também mostraram que o armazenamento de frutas atmosfera controlada diferida, em contraste com o observado para outras cultivares de pera, não foi eficaz na prevenção do AI em pera 'Rocha', podendo mesmo induzir a sua incidência. Em geral, os resultados obtidos no decorrer desta tese proporcionaram novo conhecimento e uma melhor compreensão do AI em pera 'Rocha'. Os mecanismos bioquímicos subjacentes foram estabelecidos e pistas moleculares foram desvendadas; novas perspetivas para a modelação preditiva do AI foram dadas; uma nova e promissora metodologia para a prevenção do AI foi revelada e as limitações das estratégias de controlo atualmente usadas, quando aplicadas à pera 'Rocha', foram evidenciadas.

‘Rocha’ pear (Pyrus communis L.) is a Portuguese native cultivar which can be stored under controlled atmosphere (CA) for up to ten months. However, it is known to be susceptible to internal browning disorders (IBD), one of the major causes of economic losses during long-term storage. Although many studies have been conducted to better understand IBDs in pears, the underlying mechanisms of this disorder remains to be elucidated. The aim of this thesis is to investigate the physiological, biochemical and molecular mechanisms involved on IBD development in ‘Rocha’ pear, establishing the scientific basis for the development of IBD predictive models and postharvest handling recommendations aiming at reducing the incidence of IBD in a regulatory environment where conventional chemical tools are no longer available. IBDs in pear can have various symptoms and pear susceptibility to develop this disorder has been shown to be affected by fruit maturity at harvest. In the current work IBDs in ‘Rocha’ pear were classified into two categories: wet necrotic breakdown and dry cavities, which may coexist in the same fruit. The occurrence of cavities was associated to longer storage durations and fruit exposure to high CO2. The results clearly showed that late harvested pears were more susceptible to IBD than early and optimally harvested. For the study of the biochemical basis of IBD three trials were conducted in three consecutive years. In our first assessment, conducted on a long-term basis, fermentation played a major role on IBD whereas the antioxidant system did not. However, in the second trial, conducted on a short-term basis, the results suggested that IBD in ‘Rocha’ pear was triggered by oxidative stress. Finally, in the third trial, the biochemical basis of CO2-related IBD in ‘Rocha’ pear was established. The results showed that the underlying mechanism of IBD in ‘Rocha’ pear involves the conjugation of both, the antioxidant and fermentative metabolisms. From the results obtained a mechanism of CO2-related IBD development was proposed. In this study we also looked for the first time to the molecular regulation of genes codifying antioxidant and fermentative enzymes. The differences found in the transcriptional regulation of these genes supported the biochemical findings. The results also showed that fruit storage under high CO2 leads to an impairment of the antioxidant system and that, when high CO2 is combined with very low O2 levels, there is a highly induction of fermentation with both factors acting synergistically on IBD development. We also worked to identify markers of fruit predisposition to develop IBD, which could be useful for an early assessment of the risk of IBD development. Among the biochemical markers, the results evidenced acetaldehyde (AcDH), ethanol (EtOH) and ascorbic acid (AA) as the most promising ones, whereas, among the minerals, copper (Cu) was the best candidate. Overall, IBD prediction models for ‘Rocha’ pear have been developed and validated in this work, representing a major step forward in the prediction of IBD in ‘Rocha’ pear. In order to find effective control strategies to prevent IBD in ‘Rocha’ pear three trials were conducted in two consecutive years. Two trials were conducted in the first year and the other in the following year. In the first trial, dynamic controlled atmospheres monitored by chlorophyll fluorescence (DCA-CF) and ethanol (DCA-EtOH) were evaluated for IBD prevention. For the first time, we showed that fruit storage under DCA-CF leads to a reduced IBD incidence, making it a promising methodology for ‘Rocha’ pear long-term storage. On the contrary, we also showed that storage under DCA-EtOH may not be suitable to prevent IBD. In the second and third trials, the efficacy of 1-MCP treatment and storage under delayed CA, in preventing IBD was assessed. For the first time, we showed that 1-MCP efficacy is dependent on fruit maturity at harvest and that, when applied to late harvested fruits, induces higher IBD incidence. The results also showed that fruit storage under delayed CA, in contrast to the observed for other pear cultivars, was not effective in preventing IBD in ‘Rocha’ pear, and may even induce its incidence. Overall the results obtained in the course of this thesis provided novel knowledge and a better understanding of IBDs in ‘Rocha’ pear. The underlying biochemical mechanisms were established and molecular clues were unraveled; new perspectives for IBD predictive modelling were provided; a new promising methodology for IBD prevention was revealed and the limitations of currently used control strategies, when applied to ‘Rocha’ pears, were evidenced.