Comparing ex vivo human blood model with in vitro mammals blood models for phenotypic characterization of Staphylococcus Epidermidis

Abstract

Staphylococcus epidermidis é uma bactéria comensal presente na pele e nas membranas mucosas humanas. Através da implantação de dispositivos médicos esta pode entrar na corrente sanguínea e provocar infeções graves, em particular, em recém-nascidos e em pacientes imunocomprometidos. Essas infeções são difíceis de diagnosticar e de tratar, resultando num aumento das taxas de morbilidade e mortalidade. Assim, devido à relevância clínica das infeções provocadas por S. epidermidis e devido à necessidade de encontrar novas opções de tratamento, o estudo dos fatores de virulência desta bactéria é de grande importância. Para tal, vários modelos biológicos têm vindo a ser utilizados, tendo o modelo ex vivo de sangue humano despertado especial interesse, uma vez que permite o estudo da bactéria no contexto das infeções da corrente sanguínea sem necessitar de instalações ou técnicos especializados. No entanto, apesar dessas vantagens, este modelo também apresenta limitações, especialmente no que diz respeito à disponibilidade de dadores, dificultando a sua implementação no contexto académico. Assim, o objetivo desta dissertação foi superar essa limitação propondo a substituição do sangue humano fresco por sangue comercial de outros mamíferos. Para testar esta hipótese, a sobrevivência de várias estirpes de S. epidermidis, a secreção de proteases e o nível de transcrição dos genes sepA e hld foram estudados após a interação com sangue humano fresco e sangue comercial de cavalo e de carneiro. Os resultados obtidos mostraram que embora em sangue humano se tenha verificado uma diminuição no número bactérias (entre 4 e 6×) durante o período de incubação (4 horas), em ambas as concentrações de inóculo testadas (108 e 105 CFU/mL), nos sangues comerciais de carneiro e cavalo foi observado um aumento do número de bactérias (entre 2 e 4×). Relativamente à secreção de proteases, nas duas concentrações de bactéria estudadas, a substituição de sangue humano pelos sangues de cavalo ou carneiro parece não ter causado alterações significativas. Finalmente, a expressão genética foi variável nas diferentes condições, com o gene sepA a ser transcrito ao mesmo nível nos 3 sangues, mas com a transcrição do gene hld significativamente mais elevada em sangue humano (entre 5 e 50×). De uma forma geral, os resultados obtidos indicam que dependendo dos parâmetros sob estudo, o sangue humano fresco poderá ou não ser substituído pelos sangues comerciais de cavalo ou carneiro, implicando, assim, uma análise prévia à sua substituição.

Staphylococcus epidermidis is a commensal bacterium of healthy human skin and mucous membranes. Through the implantation of medical devices, S. epidermidis can enter the bloodstream and cause serious infections, in particular in neonates and in immunocompromised patients. These infections are difficult to diagnose and to treat, resulting in increased morbidity and mortality rates. Thus, due to the clinical relevance of the infections caused by S. epidermidis and the urgent need to find new treatment options, the study of its virulence factors is of paramount importance. To do so, several biological models have been used, having ex vivo human blood model gained special interest since it does not require neither specialized facilities nor personnel, and because it enables the study of S. epidermidis in the context of a bloodstream infection. However, despite these advantages, this model also has important limitations, mainly related to availability of donors, complicating its implementation in the academic context. Hence, the aim of this dissertation was to overcome this limitation by proposing the replacement of human blood by commercial bloods from other mammals. To test this hypothesis, the survival of several S. epidermidis strains, the secretion of proteases and the level of transcription of the genes sepA and hld were determined after interaction with fresh human blood and commercial horse and sheep bloods. The results obtained showed that although in human blood the number of bacteria tended to decrease (4 to 6-fold) during the period of incubation (4 hours), in the two inocula used (108 and 105 CFU/mL), in both horse and sheep bloods a significant increase in the number of bacteria was observed (2 to 4-fold). To what concerns the secretion of proteases, in both inocula tested, our results suggested that the replacement of human blood by horse or sheep did not cause significant alterations. Finally, gene expression under the different conditions was variable, with sepA being similarly expressed in the 3 tested bloods, but with hld being significantly higher expressed in human blood (5 to 50-fold) Overall, the results obtained show that depending on the parameters under analysis, fresh human blood may or not be replaced by commercial horse or sheep bloods implicating, thus, a previous evaluation of its substitution.