Restrição de Glucose na Linha Celular do Plexo Coroide de Rato (Células Z310): Efeito na Remoção do Péptido ß-amiloide

Abstract

O metabolismo anormal da glucose sistémica é um dos fatores patológicos que influenciam o início e progressão da doença de Alzheimer. A formação de produtos de glicação avançada (AGE), o aumento do nível de espécies reativas de oxigénio (ROS), e consequentemente, do stress oxidativo provocam a disfunção mitocondrial, levando à acumulação do péptido ß-amiloide (Aß). O plexo coroide (CP) tem um papel fundamental na remoção do Aß do líquido cefalorraquidiano (CSF), evitando a sua acumulação e consequente morte neuronal e declínio cognitivo. A restrição calórica (RC) tem sido apontada como um fator relevante de intervenção nesta patologia. A RC contribui para que haja uma reprogramação metabólica, nomeadamente aumentando a biogénese mitocondrial, reduzindo a produção de ROS promovendo o aumento da capacidade respiratória e, consequentemente, a capacidade de sobrevivência em condições adversas. No entanto, nenhum estudo avaliou até agora o efeito da RC em células de CP, de forma a perceber se esta condição tem um efeito positivo na remoção de Aß. O objetivo deste trabalho foi avaliar de que forma alguns processos biológicos como a apoptose, a atividade mitocondrial e a produção de ROS na linha celular de CP – células Z310 - variam com a RC, e como esses processos podem interferir na remoção de Aß. Começámos por caracterizar o perfil metabólico da linha celular Z310 através da analise da expressão dos genes dos transportadores de glucose, Glut1 e Glut4, dos intervenientes na via de sinalização da insulina, IGF1 e IRS1, por PCR, e a localização e presença das respetivas proteínas por imunocitoquímica (IC). De seguida definimos o perfil de restrição calórica ótimo, recorrendo à determinação da viabilidade celular com azul de tripano e análise da expressão diferencial dos genes biomarcadores de restrição PGC-1a e Hsp105 por real time PCR, em que se verificou que o perfil ótimo foi de 1,5 gL-1 de glucose durante 48 horas. Posteriormente foram avaliados através de ensaios TUNEL e IC à Casp 3, parâmetros de apoptose celular, e, através da IC da Cox IV, sonda MitoSOX e DCFDA parâmetros de atividade mitocondrial e stress oxidativo com e sem estimulo com Aß. A partir dessa análise concluiu-se que a RC ótima melhora a função mitocondrial, levando à redução da produção mitocondrial de espécies superóxido bem como à inibição da ativação da via apoptótica, sem que haja variação de atividade mitocondrial. Não obstante, a RC sinergicamente com o estímulo de Aß potencia quer a atividade mitocondrial quer a produção de ROS. Finalmente a análise densitométrica às bandas de Aß obtidas por western blot dos distintos meios em RC não revela diferença nas concentrações finais de Aß remanescente no meio. Desta forma não ficou demonstrado que a RC aumenta a remoção do Aß pelas células Z310.

The abnormal systemic glucose metabolism is a pathological factor that influences the onset and progression of Alzheimer's disease. The formation of advanced glycation end products (AGE), the increase of reactive oxygen species (ROS) levels, and consequently, oxidative stress and mitochondrial dysfunction, lead to the accumulation of ß-amyloid peptide (Aß). The choroid plexus (CP) has a key role in the removal of Aß from cerebrospinal fluid (CSF), preventing his accumulation and consequent neuronal death and cognitive decline. Caloric restriction (CR) has been implicated as a relevant intervention factor in this disease. RC contributes to a metabolic reprogramming, particularly, by increasing mitochondrial biogenesis, reducing ROS production, promoting increased respiratory capacity and hence survivability under adverse conditions. However, so far there are no studies that have evaluated the effect of RC in CP cells in order to understand if this condition has a positive effect on the removal of Aß. The objective of this study was to assess how some biological processes such as apoptosis, mitochondrial activity and the production of ROS in the CP cell line - Z310 cells - vary with the RC, and how these processes can interfere with Aß removal. We began by characterizing the metabolic profile of the cell line Z310 through the analysis of gene expression of glucose transporters, Glut1 and Glut4, those involved in the signaling pathway of insulin, IGF1 and IRS1, by PCR, and the location and presence of the respective proteins by immunocytochemistry (IC). Then, we defined the optimal profile of caloric restriction, by determining the cell viability with trypan blue and analyzing the differential expression of genetic biomarkers of restriction, Hsp105 and PGC-1a by real time PCR, where it was found that the optimum profile was 1.5 gL-1 of glucose for 48 hours. Subsequently, parameters of cellular apoptosis were assessed by TUNEL assays and IC of Casp 3, and parameters of mitochondrial activity and oxidative stress through Cox IV, MitoSOX probe and DCFDA, with and without stimulation with Aß. From those analyses it was concluded that CR improves mitochondrial function, leading to reduced production of mitochondrial superoxide species and inhibition of activation of the apoptotic pathway, without changes in mitochondrial activity. However, the RC synergistically with the stimulation of Aß enhances either the mitochondrial activity as the production of ROS. Finally, a densitometric analysis of the Aß bands obtained by western blot of different media in RC shows no difference in final concentrations of Aß remaining in the medium. Thus we couldn’t proof that CR increases the removal of Aß by Z310 cells.