Análise da expressão e função dos recetores de compostos amargos no plexo coroide

Abstract

O plexo coroide (CP) é uma estrutura altamente vascularizada, localizada nas cavidades ventriculares cerebrais, que forma a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano (BSLCR), uma das barreiras protetoras do cérebro. Das inúmeras funções desempenhadas por esta estrutura, destaca-se a secreção do LCR e a regulação da passagem de moléculas entre a corrente sanguínea e o LCR. Recentemente, foi descrita a presença da via de sinalização do paladar no CP de rato, o que levanta a possibilidade de que esta via possa estar também envolvida na deteção e regulação da concentração dos compostos que circulam no LCR e no sangue, fazendo parte do mecanismo de vigilância química do CP. Propomos que os TAS2R presentes no CP possam ter um papel ativo na regulação da composição química do sangue e do LCR, que ao reconhecerem os seus ligandos possam desencadear respostas a jusante, que poderão passar pela regulação dos transportadores de efluxo presentes na BSLCR. Este trabalho teve como principais objetivos a análise da expressão de recetores do paladar no CP humano, em particular os recetores de compostos amargos (TAS2R), e a avaliação dos efeitos da sua ativação pelo resveratrol, um conhecido ligando dos recetores TAS2R14 e TAS2R39, na função de alguns transportadores de efluxo, presentes na barreira sangue-LCR. Com este projeto detetámos transcritos de 13 TAS2Rs (TAS2R3, TAS2R4, TAS2R5, TAS2R8, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R39, TAS2R40, TAS2R41, TAS2R44, TAS2R48 e TAS2R50), de uma molécula efetora da via de sinalização do paladar (TrpM5) e de três transportadores de efluxo (ABCB1, ABCC1 e ABCC4) numa linha celular de células epiteliais de CP humano (HIBCPP), por RT-PCR. Analisámos a expressão proteica de cinco destes 13 recetores amargos (TAS2R4, TAS2R5, TAS2R10, TAS2R14 e TAS2R39), por Western Blot e imunocitoquímica. A funcionalidade dos recetores TAS2R14 e TAS2R39 foi avaliada por calcium imaging, por estimulação das células de CP com resveratrol, descrito como ligando destes TAS2R. O silenciamento dos recetores com siRNAs específicos para TAS2R14 e TAS2R39, demonstrou uma diminuição da resposta por parte das células, após estimulação com resveratrol, destacando o papel destes recetores na resposta ao resveratrol. Analisámos também a funcionalidade de um dos transportadores de efluxo em células HIBCPP e a sua capacidade em adquirirem uma conformação de barreira, tendo otimizado protocolos para os ensaios de uptake, de permeabilidade e medição da resistência transepitelial (TEER). Nesta fase, temos os protocolos otimizados, por forma a realizar experiências que nos permitirão concluir quanto à possível regulação dos transportadores de efluxo pela ativação dos recetores TAS2R.

The choroid plexus (CP) is a highly vascularized structure located in the cerebral ventricular cavities, which forms the blood-CSF barrier (BCSFB), one of the protective barriers of the brain. Of the numerous functions performed by this structure, the secretion of CSF stands out, along with the regulation of the passage of molecules between the blood stream and the CSF. Recently, the presence of the taste signaling pathway in mice CP, raising the possibility that this pathway may also be involved in the detection and regulation of the concentration of compounds that circulate in the CSF and in the bloodstream, being part of the CP’s chemical surveillance mechanism. We propose that the TAS2R present in the CP may have an active role in the regulation of the chemical composition of blood and CSF, that by recognizing their ligands they may trigger downstream responses, which may consist in the regulation of efflux transporters present in the BCSFB. This work had as the main objectives the analysis of the expression of taste receptors in the human CP, particularly the bitter taste receptors (TAS2R) and the evaluation of the effects of its activation by resveratrol, a known ligand of the receptors TAS2R14 and TAS2R39, in the function of some efflux transporters present in the BCSFB. In this project we detected transcripts of 13 TAS2Rs (TAS2R3, TAS2R4, TAS2R5, TAS2R8, TAS2R10, TAS2R13, TAS2R14, TAS2R39, TAS2R40, TAS2R41, TAS2R44, TAS2R48 e TAS2R50), of an effector molecule of the taste signaling pathway (TrpM5) and 3 efflux transporters (ABCB1, ABCC1 e ABCC4) in a human epithelial CP cell line (HIBCPP), by RT-PCR. We analyzed the protein expression of 5 of these bitter receptors (TAS2R4, TAS2R5, TAS2R10, TAS2R14 e TAS2R39) by Western-Blot and immunocytochemistry. The functionality of the TAS2R14 and TAS2R39 was evaluated by calcium imaging, after the stimulation of CP cells by resveratrol described as a ligand of these TAS2R. The silencing of the receptors with specific siRNAs for TAS2R14 and TAS2R39 demonstrated a diminishing response in the cells, after stimulation with resveratrol, highlighting the role of these receptors in the response to resveratrol. We also analyzed the functionality of an efflux transporters in HIBCPP cells and their ability to acquire a barrier conformation having optimized the uptake, permeability and transepithelial electrical resistance measuring (TEER) assays. At this stage, everything is set up to perform experiments which will allow to conclude about a possible regulation of efflux transporters by the activation of TAS2R receptors.