Υγρή βιοψία: ανάπτυξη και κλινική αξιολόγηση νέων μη - επεμβατικών μεθόδων μοριακής διαγνωστικής για την παρακολούθηση ασθενών με καρκίνο

Abstract

Liquid biopsy, based on the analysis of circulating tumor cells (CTCs) and circulating tumor DNA (ctDNA), circulating miRNAs and exosomes provides a non-invasive, real-time monitoring of tumor evolution and therapeutic efficacy.In the present PhD thesis, we evaluated the effect of pre-analytical conditions on gene expression analysis in CTCs. For this purpose, we performed spiking experiments of 100 MCF7 cells into different peripheral blood collection tubes. Furthermore, CTCs were isolated using EpCAM-positive immunomagnetic enrichment at 0h, 24h and 48h and gene expression was quantified using RT-qPCR for CK-19 and B2M. At the same time, we performed a systematic quality control for all steps involved in the procedure for gene expression analysis in liquid biopsy. Our results indicate that CTC-analysis at the mRNA level is severely impeded by the preservatives or/and anticoagulants used in most peripheral blood collection tubes.Furthermore, our next aim was to select the optimal isolation/enrichment system for CTC downstream molecular characterization in HNSCC. For this reason, we directly compared for the first time the performance of ParsortixTM device, a label-independent size-based microfluidic device versus an EpCAM-based CTC enrichment system using identical blood draws from patients with HNSCC, and downstream molecular characterization at the gene expression level. Our data clearly indicate that the CTCs population enriched using the ParsortixTM device is of higher purity than that of CTCs isolated using EpCAM positive immunomagnetic CTC enrichment.We additionally developed a multiplex RT-qPCR for the simultaneous quantification of AR-full length (AR-FL), splice variants AR-V7, AR-567 and AR-Total with hybrolysis probes in Cobas z480 (Roche Diagnostics).The developed assay was applied and clinically validated in CTCs and exosomes of metastatic castration resistant prostate cancer. Our results clearly indicate that the developed assay can be applied both in CTCs and exosomes.Finally, we evaluated the molecular profile of CTCs and exosomes of patients with metastatic castration resistant prostate cancer. More specifically, we evaluated gene expression profile for PD-L1, CK-19, splice variants AR-FL, AR-V7, AR-567 and AR-total, and the methylation profile of GSTP1 and RASSF1A.This PhD thesis was funded by the European Program IMI-CANCER-ID (Contract No. 115749): “Cancer treatment and monitoring through identification of circulating tumour cells and tumour related nucleic acids in blood” (https://www.cancer-id.eu/)

Η «υγρή βιοψία», βασισμένη στην ανάλυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (circulating tumor cells, CTCs), του εξωκυττάριου καρκινικού DNA (circulating tumor DNA, ctDNA), των miRNAs και των εξωσωμάτων παρέχει μια μη-επεμβατική παρακολούθηση της εξέλιξης της νόσου και της αποτελεσματικότητας της θεραπείας, σε πραγματικό χρόνο.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, αρχικά αξιολογήσαμε την επίδραση των προαναλυτικών συνθηκών για την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης στα CTCs. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν πειράματα εμβολιασμού 100 MCF7 σε σωληνάρια συλλογής περιφερικού αίματος, με διαφορετική σύσταση αντιπηκτικού και συντηρητικών των κυττάρων. Στη συνέχεια ακολούθησε η απομόνωση των CTCs με EpCAM-θετικό ανοσομαγνητικό εμπλουτισμό σε διαστήματα 0h, 24h και 48h και ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης των γονιδίων B2M και CK-19 στα CTCs με RT-qPCR. Παράλληλα, προτείνουμε μια ολοκληρωμένη διαδικασία ελέγχου ποιότητας όλων των βημάτων που συμπεριλαμβάνονται στην πειραματική πορεία για αναλύσεις γονιδιακής έκφρασης σε δείγματα υγρής βιοψίας. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι αναλύσεις των CTCs σε επίπεδο mRNA επηρεάζονται από τα συντηρητικά ή/και τα αντιπηκτικά που χρησιμοποιούνται στα περισσότερα σωληνάρια συλλογής περιφερικού αίματος.Στη συνέχεια, στόχο μας αποτέλεσε η επιλογή του βέλτιστου συστήματος απομόνωσης/εμπλουτισμού CTCs για το μοριακό χαρακτηρισμό τους στον HNSCC. Για αυτό το λόγο, πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά άμεση σύγκριση του συστήματος Parsortix, που βασίζεται σε σύστημα μικροροών για την απομόνωση/εμπλουτισμό των CTCs με βάση το μέγεθός τους, με τον ανοσομαγνητικό εμπλουτισμό των CTCs με βάση το EpCAM από το ίδιο περιφερικό αίμα ασθενών με HNSCC και προχωρήσαμε στη συνέχεια σε μοριακό χαρακτηρισμό των CTCs σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν σαφώς ότι ο πληθυσμός των CTCs που απομονώθηκε με το σύστημα Parsortix είναι υψηλότερης καθαρότητας σε σχέση με τον πληθυσμό των CTCs που απομονώθηκε με EpCAM θετικό ανοσομαγνητικό εμπλουτισμό. Επιπρόσθετα, αναπτύξαμε μεθοδολογία πολλαπλής RT-qPCR για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό της έκφρασης του υποδοχέα των ανδρογόνων (AR), AR-full length (AR-FL), των εναλλακτικών μεταγράφων του AR-V7 και AR-567 και του ολικού AR-total με ανιχνευτές υδρόλυσης στο όργανο Cobas z480 (Roche Diagnostics). Η αναπτυχθείσα μεθοδολογία εφαρμόστηκε και αξιολογήθηκε κλινικά στα CTCs και στα εξωσώματα που απομονώθηκαν από το πλάσμα ασθενών με μεταστατικό ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ξεκάθαρα ότι η μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί τόσο στα CTCs όσο και στα εξωσώματα.Στο τελευταίο μέρος της διατριβής, διερευνήθηκε το μοριακό προφίλ των CTCs και των εξωσωμάτων ασθενών με ευνουχοάντοχο καρκίνο προστάτη. Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε το προφίλ της έκφρασης των γονιδίων PD-L1, CK-19, των εναλλακτικών μεταγράφων AR-FL, AR-V7, AR-567 και AR-total, καθώς και το προφίλ μεθυλίωσης των γονιδίων GSTP1 και RASSF1A. Η διδακτορική διατριβή χρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Πρόγραμμα IMI-CANCER-ID (αρ. συμβολαίου 115749): “Cancer treatment and monitoring through identification of circulating tumour cells and tumour related nucleic acids in blood” (https://www.cancer-id.eu/)