Mελέτη της διαμόρφωσης και της δυναμικής H-NOX (heme-nitric oxide/oxygen binding) επικρατειών και των συμπλόκων τους με σηματοδοτικά μόρια μέσω φασματοσκοπίας NMR

Abstract

Nitric oxide (ΝΟ) plays a key role in the the convertion of GTP to cGMP. The main receptor of NO is the sGC enzyme. sGC is a heterodimer, composed of α1 and β1 subunit, of which the latter contains the heme binding H-NOX domain, responsible for NO recognition and binding. NO binds upon the Fe of H-NOX and triggers electronic and conformational changes, leading to the signal transmission from the H-NOX domain to the catalytic and the subsequent enzyme’s activation. Impaired function of the NO/sGC/cGMP signaling pathway has been linked several diseases, such as hypertensionand heart failure. Low bioavailability of NO inhibits the pathway while heme oxidation makes sGC unresponsive to NO. As a central player in this axis, H-NOX is the focus of intense research efforts aiming to develop therapeutic molecules that enhance the pathway’s activity. Two classes of compounds have been described that directly affect the function of sGC: stimulators which activate sGC in spite of the low NO concentration and activators which replace oxidized heme, restoring the proper function of the enzyme. H-NOX domains have been identified not only in mammals but also in bacteria.In the present thesis, we present the conformational study of three bacterial H-NOX proteins, from Nostoc sp. (Ns H-NOX), Caldanaerobacter subterraneus (Cs H-NOX) and Vibrio cholerae (Vc H-NOX) and the mode of interaction with diatomic gases and chemical compounds. By applying NMR spectroscopy, we report the conformational exchange effect during the heme replacement of Ns H-NOX domain by the activators BAY 58-2667 and BAY 60-2770, leading Ns H-NOX to adopt a more rigid conformation. Same approach is applied to determine how the stimulator BAY 41-2272 interacts withNs H-NOX domain. Combination of tow different spectroscopic techniques, we study the conformational and electronic changes of the Ns H-NOX domain after the binding of NO. Site – directed mutagenesis experiments identify the role and the participation of the two tunnels of Ns H-NOX domain, in the entry and exit of NO, as well as in the general gas migration in the protein interior. Furthermore, we report the expression and purification conditions for the sample preparation of Cs H-NOX and Vc H-NOX proteins aiming their structural and functional study via NMR spectroscopy.

Το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) συμμετέχει στη μετατροπή του GTP προς cGMP. Ο κύριος φυσιολογικός υποδοχέας για το ΝΟ είναι το ένζυμο sGC. Το ένζυμο sGC, είναι ένα ετεροδιμερές και αποτελείται από δύο υπομονάδες: την α1 και τη β1. Στο αμινοτελικό άκρο της β1 υπομονάδας εντοπίζεται ο Η-ΝΟΧ τομέας, ο οποίος φέρει ένα μόρι αίμης και είναι υπεύθυνος για την αναγνώριση και την πρόσδεση του ΝΟ. Η α1 υπομονάδα δεν φέρει Η-ΝΟΧ ή αντίστοιχο τομέα. Το ΝΟ προσδένεται στο Fe επάγοντας ηλεκτρονιακές και διαμορφωτικές αλλαγές, οι οποίες οδηγούν στη μετάδοση του σήματος από τον Η-ΝΟΧ στον καταλυτικό τομέα, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ενζύμου. Δυσλειτουργία του σηματοδοτικού μονοπατιού NO/sGC/cGMP έχει συσχετιστεί με παθολογικές καταστάσεις όπως υπέρταση και καρδιακή ανεπάρκεια. Χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ αναστέλλει τη λειτουργία του μονοπατιού ενώ με την οξείδωση του Fe, η sGC να χάνει τη λειτουργικότητά της. Συνεπώς, ο Η-ΝΟΧ τομέας αποτελεί φαρμακευτικό στόχο για το σχεδιασμό δραστικών ενώσεων με σκοπό τη ενίσχυση της λειτουργίας του μονοπατιού NO/sGC/cGMP. Δύο κατηγορίες ενώσεων έχουν αναπτυχθεί: οι διεγέρτες, οι οποίοι ενεργοποιούν την sGC σε συνθήκες χαμηλής βιοδιθεσιμότητας NO και οι ενεργοποιητές, οι οποίοι αντικαθιστούν την οξειδωμένη αίμη, επαναφέροντας τη λειτουργία του ενζύμου. Εκτός από τα θηλαστικά, Η-ΝΟΧεπικράτειες έχουν ταυτοποιηθεί και σε βακτήρια. Στην παρούσα διατριβή παρουσίαζεται η μελέτη της διαμόρφωσης τριώνβακτηριακών Η-ΝΟΧ επικρατειών, των Nostoc sp. (Ns H-NOX), Caldanaerobacter subterraneus (Cs H-NOX) και Vibrio cholerae (Vc H-NOX) και του τρόπου αλληλεπίδρασης με διατομικά αέρια και δραστικές ενώσεις. Με τη χρήση φασματοκοπίας NMR περιγράφεται το φαινόμενο διαμορφωτικής ανταλλαγής κατά την αντικατάσταση της αίμης της Ns H-NOX επικράτειας από τους ενεργοποιητές ΒΑΥ 58-2667 και ΒΑΥ 60-2770 με αποτέλεσμα η πρωτεΐνη να αποκτά πιο σταθερή διαμόρφωση, ενώ με τον ίδιο τρόπο προσδιορίζεται ο τρόπος αλληλεπίδρασης του διεγέρτη ΒΑΥ 41-2272 με την Ns H-NOX επικράτεια. Με το συνδυασμό δύο NMR και UV-vis μελετώνται οι διαμορφωτικές και ηλεκτρονιακές αλλαγές, τις οποίες προκαλεί η πρόσδεση του ΝΟ ενώ παράλληλα με πειράματα κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης της Ns H-NOX επικράτειας προσδιορίζεται ο τρόπος εισόδου και εξόδου του ΝΟ στο εσωτερικό της πρωτεΐνης ώστε να προσδεθεί στην αίμη. Επιπλέον, παρουσιάζεται έκφραση και η απομόνωση των Cs H-NOX και Vc H-NOX επικράτειών με σκοπό τη δομική και λειτουργική τους μελέτη μέσω φασματοσκοπίας NMR.