Avaliação da actividade antivírica de extractos aquosos de plantas da flora aromática portuguesa

Abstract

O objectivo deste trabalho foi avaliar in vitro a actividade antiviral de extractos aquosos de 3 espécies da família Asteraceae pertencentes à flora aromática portuguesa. Os extractos foram identificados por E3, E4, E6 e E8, tendo sido utilizado o ensaio colorimétrico do MTT para a determinação da sua citotoxicidade em células Vero. Determinaram-se os valores correspondentes à Concentação máxima não citotóxica (CMNC), a que inviabiliza 10% das células (CC10) e a que inviabiliza 50% das células (CC50). Fizeram-se ensaios de efeito virucida incubando suspensões do vírus da Encefalomiocardite murina (EMCV) com e sem os diferentes extractos e determinando, após titulação, as taxas de inactivação viral correspondentes, e a concentração que reduz em 50% o título das suspensões virais (CI50). Estudou-se ainda o efeito dos extractos em células infectadas, adicionando-os 30 minutos após o período de adsorção e titulando o vírus produzido nessas condições e em condições controlo (células infectadas não tratadas); devido à dificuldade na determinação da CMNC, foram utilizadas nestas experiências concentrações inferiores às da CC10. O extracto E6 foi o mais citotóxico com valores de CC50 igual a 270±0,02μg/ml e não apresentou acção directa sobre as partículas virais. Os restantes extractos mostraram acção directa sobre as partículas virais com valores de CI50 compreendidos entre 5±0,12 e 600±0,2μg/ml. Todos os extractos apresentaram percentagens de inibição da produção viral superior a 45%, tendo o extracto E6 atingido 96,8% de inibição. Estes resultados indicam que estes extractos, e de forma relevante o E6, actuam durante a replicação viral na célula hospedeira. Foi considerada a possibilidade de interferirem com a síntese de RNA viral, pelo que se extraiu RNA de células infectadas tratadas e não tratadas com os extractos para investigar a presença do genoma do EMCV através de um RT-PCR com primers específicos para uma região do RNA viral. A obtenção de produtos de amplificação a partir de todas as amostras de RNA, incluindo as das células infectadas na presença do extracto E6, mostrou que não é este o passo do ciclo replicativo do EMCV a ser afectado. Esta é a primeira vez que se relata a actividade antiviral de extractos aquosos de espécies da família Asteraceae frente ao EMCV.

The aim of this study was to evaluate the in vitro antiviral activity of aqueous extracts of three species belonging to the family Asteraceae from the Portuguese aromatic flora. The extracts that were identified by E3, E4, E6, and E8 have been used for the MTT colorimetric assay to determine their cytotoxicity on Vero cells. They were determined the valuescorresponding to the maximum non-cytotoxic concentration (CMNC) , the concentration causing either 10 % (CC10) and 50% (CC50) inhibition of growth of normal cells. Virucidal effect tests were performed by incubating suspensions of murine encephalomyocarditis virus (EMCV) with and without the different extracts and determining after titration, rates corresponding to viral inactivation and the concentration that reduces by 50% the title of the viral suspensions (IC50). It was also studied the effect of the extracts in infected cells by adding them to infected cells 30 minutes after the adsorption period and titrating the virus produced in these conditions and control conditions (untreated infected cells). Due to the difficulty in determining the CMNC, were used in these experiments concentrations lower than CC10. The extract E6 was the most cytotoxic with CC50 values equal to 270 ± 0.02μg/ml and showed no direct action against virus particles. The remaining extracts showed direct action on virus particles presenting IC50 values between 5±0.12 and 600±0.20 μg/ml. All extracts showed inhibition of viral yield over 45 % and the extract E6 reached 96.8 % inhibition. These results indicate that these extracts, and significantly E6, acting during viral replication in the host cell. To evaluate if the virus RNA synthesis was affected, RNA was extracted from treated and not treated infected cells. These RNA samples were then assayed for the presence of the EMCV genome, by RT- PCR with specific primers for a region of the virus RNA. The amplification products obtained from all RNA samples, including RNA from infected cells in the presence of the extract E6, showed that this step of EMCV replication was not affected. This is the first time that reports the antiviral activity of aqueous extracts of Asteraceae species against EMCV.