Shedding light on enveloped viruses entry and its inhibition using optical techniques

Abstract

Enveloped virus attachment and fusion into the host cells constitutes the first and crucial step for the life cycle of a virus and is mediated by the envelope glycoproteins. This Thesis aimed to clarify some important factors that influence this process and the mechanism of action at the molecular level of drugs that inhibit it. First, the mode of action of HIV-1 fusion inhibitor peptides at the membrane level was studied using fluorescence spectroscopy. Interaction of these peptides with human cell membranes was assessed by dipole potential sensitive probes. C34-cholesterol, one of the latest generation fusion inhibitors had the highest cell membrane affinity, followed by T-1249, enfuvirtide and sifuvirtide. Sifuvirtide however showed strong preference for rigid membrane domains, mimicked by dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), while C34-cholesterol strongly partitioned to cholesterol and sphingomyelin-rich model membranes. The overall results establish a relationship between these drugs antiviral activity and their membranotropism towards raft-like membrane compositions, following the trend C34-cholesterol > T-1249 > enfuvirtide. The capacity of the peptides to concentrate on lipid rafts microdomains, near the cell receptors for the virus, would make them more available to bind the viral gp41 in its exposed conformation. We then focused on another aspect of the HIV-1 entry related to envelopereceptor interactions, namely with glycosaminoglycans. Their general structural requirements of that enable the binding to gp120 were determined by surface plasmon resonance. Binding was found to be dependent on sequence type and size, preferring heparin and heparan sulfate, with an extension of at least 12 monomers. Sulfate groups were essential for the interaction. These results help to understand some basic mechanisms of viral attachment. Although envelope-receptor interactions play a pivotal role in the viral entry, lipids are also relevant. The role of acidic lipids in the viral fusion kinetics of vesicular stomatitis pseudoviruses (VSV) was assessed by single-particle imaging x on supported lipid bilayers. Phosphatidylserine (PS) and bis(monoacylglycero)phosphate (BMP) greatly enhanced the efficiency of hemifusion and enabled full fusion. The lag between lipid and content mixing defining the lifetime of a hemifusion intermediate were significantly shorter for BMP-containing compared to PS-containing bilayers. BMP is a late endosomeresident lipid and its effect on promoting VSV fusion makes it an important modulator on the outcome of viral entry through endocytosis. Evolving from model membranes to cells, the internalization and fusion of a retrovirus through endocytosis was imaged. A pH-sensor consisting of two fused fluorescent proteins mTFP1-eYFP was incorporated in the envelope of an avian sarcoma and leucosis virus (ASLV). The pH values were quantified along the virus track and varied from 5.6 to 6.5 in early endosomes. Single-virus tracking showed that ASLV, upon internalization, are sorted into distinct pools of early endosomes with different dynamics, depending on using the two receptor isoforms, TVA800 or TVA950. Overall, this Thesis sheds light on important host factors that influence enveloped virus entry and fusion, establishing lipid binding as a key player in the action of peptide fusion inhibitors.

O ciclo de vida dos vírus depende da sua capacidade de reconhecer as células do hospedeiro, ligar-se a sua superfície através de receptores específicos e transferir o seu conteúdo genético para o interior dessas células. Deste modo, os componentes virais apropriam-se da maquinaria intracelular de modo a replicarem-se. Para isso, os vírus envelopados tem de fundir a membrana lipídica que os envolve com a membrana da célula hospedeira. As glicoproteínas do envelope viral são responsáveis pelo reconhecimento do(s) receptor(es) celular(es) e pela mediação desta fusão. No entanto, os mecanismos pelos quais a entrada e fusão viral se processam ainda não estão totalmente compreendidos, por exemplo, ao nível das interacçoes envelope-receptor, dos intermediários de fusão e das vias de entrada para o interior das células. Esta Tese explora detalhes moleculares da aderência, fusão e entrada de vírus envelopados usando sistemas modelo de membranas e receptores, além de mecanismos de accão de péptidos inibidores do vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). No primeiro capítulo, a influência das membranas no modo de accão de péptidos inibidores de fusão do HIV-1 foi estudada usando espectroscopia de fluorescência. Estes péptidos inibem as alterações conformacionais da gp41, proteína do envelope que permite a fusão da membrana do vírus com a da célula hospedeira. Deste modo, o vírus fica impedido de entrar na célula e prosseguir com o seu ciclo de vida. O enfuvirtide é o único fármaco deste tipo aprovado até agora para uso clinico. No entanto, estudamos também outros péptidos inibidores de fusão, mais potentes mas ainda experimentais: o T-1249, o sifuvirtide e o C34- colesterol, listados por ordem crescente de potência antiviral. Em estudos anteriores dos grupos de investigação onde estive inserido, foi estudada a interacção dos péptidos enfuvirtide, T-1249 e sifuvirtide com modelos de membrana (vesiculas lipídicas) de composições definidas. Nos estendemos esse conhecimento para estudos com células sanguíneas humanas, eritrócitos e linfócitos, usando sondas fluorescentes de membrana sensíveis ao potencial dipolar. Nos primeiros estudos, o T-1249 revelou-se como aquele que interage mais com as membranas das células, seguido do enfuvirtide, sendo o sifuvirtide o que apresentava menor afinidade. No entanto, estudos adicionais de potencial dipolar em vesiculas confirmaram a preferência do sifuvirtide para domínios de membrana rígidos, mimetizados por modelos de membranas do lípido dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). O membranotropismo de largo espectro, em vesiculas e células, do T-1249 pode ser um dos factores que explicam a sua mais actividade em relação ao enfuvirtide. No caso do sifuvirtide, a alta especificidade para domínios rígidos de membrana, as chamadas jangadas lipídicas (lipid rafts), pode contribuir também para a sua potência, dado que são os locais onde a fusão viral e mais provável de ocorrer a nível das membranas das células. O C34-colesterol e um dos inibidores de fusão de última geração, mais potente que os referenciados anteriormente. Trata-se de um conjugado formado pelo péptido C34 ligado a uma molécula de colesterol. Para este fármaco, foi efectuado um estudo completo em sistemas modelo de membranas e células humanas. O C34-colesterol teve uma partição substancialmente mais alta para vesiculas lipídicas e células, comparado com a forma não conjugada, C34. O conjugado apresentava uma preferência para composições lipídicas ricas em colesterol e esfingomielina, típicas das jangadas lipídicas. De entre todos os péptidos estudados, o C34-colesterol apresentava a maior afinidade para as membranas das células: em linfócitos, 14 e 115 vezes maior afinidade que o T-1249 e o sifuvirtide, respectivamente. Ao longo destes estudos da accão dos peptidos a nivel da membrana, podemos estabelecer uma relação entre actividade antiviral e a apetência para ligação as membranas e as jangadas lipídicas, seguindo a ordem C34-colesterol > T-1249 > enfuvirtide. Esta correlação pode ser explicada pela capacidade destes fármacos se concentrarem ao nível das jangadas lipídicas, onde a interacção virus-receptor, e consequente fusão, e mais provável de ocorrer. A grande disponibilidade do péptido nesse local facilita a subsequente interacção do péptido com a conformação exposta da glicoproteína gp41. Outro aspecto da entrada do HIV-1 relacionado com interaccões envelopereceptor e apresentado no capítulo 2. Este processo, mediado pela glicoproteína do envelope gp120 depende não só do receptor principal CD4 e co-receptores CCR5/CXCR4 mas também de receptores adjuvantes que melhoram a aderência do vírus as células. Neste caso, foi estudado a interacção da gp120 com glicosaminoglicanos, os componentes glicídicos dos proteoglicanos. Estes proteoglicanos, principalmente os de sulfato de heparano a superfície das células, são muito relevantes na dispersão e patogénese do vírus num contexto de infecção do organismo. Determinaram-se genericamente os requisitos estruturais dos glicosaminoglicanos que permitem a ligação a gp120, através da técnica de ressonância de plasmão de superfície ou espectroscopia de onda evanescente (SPR, Biacore). Esta ligação foi identificada como dependente do tipo de sequência do glicosaminoglicano, com preferência pela heparina e sulfato de heparano e menor ligação aos sulfatos de condroitano e dermatan. A extensão mínima de heparina necessária para a ligação foi definida como 12 monómeros, nas nossas condições. Também de relevância foi o facto dos grupos sulfatos serem essenciais para promover esta ligação, sendo que glicosaminoglicanos parcialmente ou totalmente desulfatados não apresentavam ligação. Estes estudos são relevantes para melhor compreender os mecanismos básicos de aderência do HIV as células, antes da interacção com o receptor principal, CD4. A interacção envelope receptor tem um papel fundamental na fusão e entrada dos vírus envelopados. No entanto outros factores do hospedeiro podem modular este processo, nomeadamente os próprios lípidos das membranas celulares. No terceiro capítulo, o papel dos fosfolípidos aniónicos na cinética de fusão do vírus da estomatite vesicular (VSV, vesicular stomatitis virus) foi avaliado através de visualização de partículas individuais sobre bicamadas lipídicas suportadas. Foi utilizado uma camara contendo dois canais microfluídicos sobre uma lamela de vidro, previamente tratada com dextrano. Nestes microcanais, as bicamadas lipídicas foram formadas sobre o dextrano. Apos isto, os vírus aderiam e puderam ser observados ao microscópio. Estes vírus incorporavam duas sondas fluorescentes: um marcador lipofílico de membrana e uma proteína fluorescente no interior do vírus, acoplada a nucleocapside. Esta dupla marcação permitia a detecção da mistura dos lípidos do vírus e da bicamada aquando da hemifusão, e também da libertação do conteúdo viral, confirmando a fusão. Estas observações revelaram que a presença de fosfatidilserina (PS) e de bis(monoacilglicero)fosfato (BMP) aumentam a eficiência da hemifusão e permitiam a progressão para fusão completa, ao contrário de membranas contendo apenas o lípido zwitterionico fostatidilcolina (PC). Adicionalmente, o tempo entre o início da hemifusão e a libertação do conteúdo viral (isto e, o tempo de vida do passo intermediário de hemifusão) era significativamente mais curto para o caso do BMP, em comparação com a PS. O BMP e de facto um lípido que se encontra em abundância especificamente nos endossomas tardios e nos corpos multivesiculares das células, onde a fusão do VSV e mais provável de ocorrer. O BMP pode constituir um factor importante que permite a fusão completa do vírus quando este e internalizado. No último capítulo, evoluímos da fusão de vírus em sistemas modelo de membranas para células e visualizamos a viagem intracelular de um retrovírus, contendo uma sonda de pH, pela via endossomal. Este sensor consistia em duas proteínas fluorescentes fundidas (mTFP1-eYFP) que foram incorporadas no envelope de um vírus da leucose e sarcoma aviário (ASLV, avian sarcoma and leukosis vírus). Através de transferência de energia (FRET) entre estas duas proteínas foi possível quantificar o pH a medida que o endossoma onde se encontrava o vírus ia acidificando. Este retrovírus requer dois estímulos sequênciais para fundir com a membrana do endossoma: ligação ao receptor de membrana e pH acídico. O receptor utilizado por este vírus existe em duas isoformas: o TVA950 que e transmembranar e o TVA800 que e ancorado por um grupo glicosilfosfatidilinositol (GPI). Os valores de pH quantificados variavam ao longo do percurso de 6.5 a 5.6. A fusão foi observada pela libertação de uma proteína fluorescente associada a nucleocapside. As células que expressavam TVA950 distribuíam os vírus para endossomas que se moviam mais lentamente, ao contrário das células TVA 800 que eram indiferentes. Adicionalmente, as TVA950 suportavam uma fusão mais rápida que as TVA800, apesar dos valores de pH parecidos nos endossomas. Os resultados mostraram que apos internalização, o ASLV e distribuído em diferentes grupos de endossomas, que se distinguem por terem diferentes dinâmicas de mobilidade e que modulam a fusão de modo distinto. Em suma, esta tese tratou de esclarecer alguns factores importantes que influenciam a fusão e entrada de vírus envelopados, nomeadamente ao nível lipídico e das interacções envelope-receptor. Estabelecemos ainda que a apetência de ligação as membranas dos péptidos inibidores de fusão do HIV-1 e um factor importante no seu modo de acção e deve ser tido em consideração no design de novos fármacos deste tipo.