Estudo do direcionamento ativo de nanossistemas lipídicos com antagonista G para células de cancro de pulmão

Abstract

O carcinoma de pequenas células do pulmão é um tipo particularmente agressivo de cancro do pulmão estando a ser desenvolvidas novas abordagens, como sistemas de veiculação de fármacos, de modo a criar terapias mais eficazes. Os lipossomas de longo tempo de circulação são um dos sistemas mais promissores, tendo tido algum sucesso em aplicações clínicas noutras patologias, visto que têm a capacidade de aumentar a eficácia dos compostos terapêuticos usados, podendo ser direcionados seletivamente para células alvo. O objetivo deste trabalho foi estudar a capacidade do hexapéptido antagonista G – o agente de direcionamento escolhido – em aumentar seletivamente a internalização de lipossomas de longo tempo de circulação na linha celular humana de carcinoma de pequenas células do pulmão (H69). Para isso, foram estudados dois métodos distintos para ligar covalentemente o péptido a este tipo de lipossomas previamente formados. Assim, após a ativação do péptido com um grupo sulfidrilo, procedeu-se à sua ligação covalente ao DSPE-PEG2000-maleimida, um constituinte da bicamada lipídica dos lipossomas ou de micelas, consoante se estivesse a utilizar o método de ligação direto ou de pós-inserção. Obtiveram-se lipossomas com as mesmas caraterísticas e com elevado rendimento de ligação, sendo que este último parâmetro foi superior no método direto. Foi igualmente estudado o efeito da carga (neutra ou catiónica) da bicamada lipídica revestida com PEG2000 na conjugação de antagonista G aos lipossomas, tendo-se observado a não existência de diferenças nas suas caraterísticas e que, em ambos os casos, a ligação do péptido tinha ocorrido de forma eficaz. Estes dois tipos de formulações foram marcados com rodamina B para a realização de estudos in vitro na linha celular H69, tendo-se analisado a sua ligação aos recetores celulares e possível internalização de forma qualitativa, por microscopia de fluorescência, e quantitativa, através de citometria de fluxo. Por microscopia de fluorescência observou-se que o direcionamento dos lipossomas com antagonista G aumentava a sua associação celular nas células H69. No entanto, por citometria de fluxo os resultados não foram conclusivos, havendo necessidade de repetir estes ensaios quantitativos em diferentes condições.

Small cell lung carcinoma (SCLC) is a very aggressive subtype of lung cancer and, in an attempt to create more effective treatments, are being developed new approaches, such as drug delivery system. Some of them are already successfully applied in some pathologies’ treatment and one of the most promising systems are liposomes sterically stabilized with poly(ethylene glycol)-lipid derivatives because of its ability to enhance the efficacy of the therapeutic compounds and their capacity to be targeted to specific cells. The aim of this work was to study the ability of antagonist G, a peptide targeting agent, to selectivity improve the internalization of long circulating liposomes in the human SCLC cell line (H69). For that purpose, two different methods were studied in order to covalently attach antagonist G to previously prepared long circulation liposomes. Firstly, antagonist G was activated with a sulfhydryl group, which was then covalently linked to DSPE-PEG2000-maleimide from liposomes or micelles, depending on the method being used – direct or post-insertion method. Liposomes prepared by both methods displayed the same characteristics and a high coupling efficiency but liposomes prepared by the direct method were more efficient in antagonist G’s coupling. The effect of the lipid bilayer’s charge (neutral or cationic) coated with PEG2000 in the coupling of antagonist G to liposomes was also studied. No charge-dependent changes in liposome characteristics were found and both formulations can efficiently link antagonist G to liposomes. The in vitro internalization in the H69 cell line was followed qualitatively by fluorescence microscopy, using targeted and non-targeted liposomes of both types labeled with rhodamine B. Results showed that the targeting of liposomes with antagonist G increased its cellular association. An attempt at quantifying liposome internalization in H69 was made using flow cytometry, but results weren’t conclusive and so the quantitative analysis should be repeated under different conditions.