Selection of single domain antibodies against the CD20 receptor: a new treatment with potencial anti-tumor properties for B-cell malignancies

Abstract

Lymphoma is the third most common neoplasia in the world. Within lymphomas, non-Hodgkin lymphoma (NHL) is the most common affecting mainly B cells. For more than three decades, chemotherapy and radiotherapy have been the only treatments available, but since the discovery of Rituximab, a new era of lymphoma therapy was inaugurated, once it was the first monoclonal antibody approved against the CD20 receptor. The CD20 receptor is an antigen expressed on the B-cells surface, and it is present nearly in all of its maturational development, being absent only in the stages of the pro-B lymphocyte and plasma cells. Furthermore, the CD20 receptor is also present on >90% of the B-cell NHL. These characteristics make this receptor an ideal target for immunotherapy. Besides the success of Rituximab, various mechanisms of resistance have been developed by the tumoral cells against this antibody, such as the decrease of the CD20 expression on B-cells, immunogenicity, structural changes affecting the binding region of the CD20 antibody or alterations in the cell membrane. New anti-CD20 antibodies have been developed to overcome the disadvantages of Rituximab, such as Ofatumumab and Obinutuzumab, presenting a different immunogenicity and binding to the different epitopes on the target with a different affinity. Apart from the progress in the lymphoma therapy, a significant population of patients still succumbs to this disease, as tumoral cells are always changing, making the search for better antibodies a never-ending process. Thus, the aim of this project consisted in the development and characterization of a new antibody against the CD20 receptor. To achieve this goal, the potential of rabbit derived single-domain antibodies (sdAbs) as therapeutic molecules were explored. For that, one rabbit was immunized with the CD20 receptor and an immune VH and VL sdAb library was generated. Then, a subtractive cell phage display screening was used for antibody selection. This approach allowed a specific selection of one sdAb in the VL format against the CD20 receptor in cells. In summary, the strategy explored in the present project resulted in an antibody that, according to its characteristics, could be a promising candidate in the treatment of NHL and other B-cell malignancies.

Os linfomas são a terceira neoplasia mais comum no mundo, sendo os linfomas não-Hodgkin os mais frequentes. Dentro dos linfomas não-Hodgkin, cerca de 85-90% são de células B. Os linfomas desenvolvem-se maioritariamente a partir dos nódulos linfáticos, no entanto podem formar-se a partir de qualquer outro tecido. Durante mais de três décadas, os únicos tratamentos disponíveis para esta doença eram a quimioterapia e a radioterapia. No entanto, com a descoberta do Rituximab, um anticorpo específico para o recetor CD20 presente nos linfomas de células B, começou uma nova era no campo das imunoterapias. O anticorpo Rituximab, uma vez que foi o primeiro a ser descoberto, faz parte da primeira geração de anticorpos anti-CD20. Este é um anticorpo quimérico, uma vez que é constituído por um IgG1 glicosilado composto por uma região constante kappa humana e regiões variáveis leves e pesadas murinas. Este anticorpo atua essencialmente através de três principais mecanismos de ação: citotoxicidade mediada por anticorpos (ADCC); citotoxicidade dependente do complemento (CDC) e indução da apoptose. O recetor CD20 é uma molécula expressa na superfície das células B e está presente na maioria das fases de maturação destas células, com exceção da fase de linfócitos pró-B e nas células plasmáticas. Para além disso, está presente em mais de 90% dos linfomas não-Hodgkin de células B. No entanto, apesar da sua função ainda não ser totalmente conhecida, pensa-se que possa estar envolvido no fluxo de cálcio. Este recetor é uma fosfoproteína não glicosilada com 4 domínios membranares: os domínios N e C terminal que são intracitoplasmáticos e 2 loops adicionais que são extracelulares. Devido a estas suas características, o recetor CD20 é considerado um bom alvo para imunoterapias, nomeadamente terapias para linfomas não-Hodgkin de células B. Apesar do sucesso do Rituximab, têm vindo a ser descritos vários mecanismos de resistência das células tumorais contra este anticorpo, nomeadamente a diminuição da expressão de CD20, mudanças estruturais que afetam o local de ligação do anticorpo à molécula ou alterações na membrana da célula, o que diminuiu a sua eficácia. Este aspeto fez com que fosse necessária a contínua procura por novos anticorpos para colmatar as lacunas do Rituximab. Assim, ao longo dos anos, foram descobertos novos anticorpos específicos para CD20, como o Ofatumumab e o Obinutuzumab, que têm uma diferente imunogenicidade e reconhecem diferentes epítopos na molécula CD20 aos quais se ligam com diferentes afinidades, atuando assim com diferentes mecanismos de ação. Ainda assim, este tipo de doença continua a afetar imensas pessoas, muitas vezes não existindo um tratamento eficaz devido às múltiplas resistências das células tumorais. Tendo em conta este contexto e uma vez que os anticorpos disponíveis no mercado não conseguem resolver estes problemas, a procura por novos anticorpos mais vantajosos continua. Atendendo a esta necessidade, o objetivo deste projeto é o desenvolvimento e caracterização de um anticorpo de pequeno domínio específico para CD20. Os anticorpos de pequenos domínios têm várias vantagens em relação aos IgGs completos, principalmente devido ao seu reduzido tamanho, que faz com que estes anticorpos tenham melhor acesso ao alvo na superfície da célula, para além disso podem ainda ser facilmente expressos em bactérias como proteína. Têm ainda a vantagem, como moléculas terapêuticas, de serem mais estáveis em circulação que os anticorpos completos. Estas características permitem uma administração de maiores quantidades por grama de produto, o que leva a um aumento significativo da potência por dose e na redução do custo de produção. Para o desenvolvimento do projeto, inicialmente foi imunizado um coelho com o péptido CD20 e com células HEK 293T transfetadas com o recetor CD20. Antes de cada imunização, o soro era recolhido para ser avaliado através de ELISA. Ao dia 89, quando foi atingido um elevado título de anticorpos, procedeu-se à recolha do soro final e à eutanásia do coelho. Os ensaios de ELISA permitiram confirmar que o soro extraído após as imunizações estava a reconhecer não só as células Raji, que contêm à sua superfície CD20, mas também o péptido CD20, por outro lado o soro recolhido antes das imunizações não reconhecia nem as células Raji, nem o péptido. Após a eutanásia, foram recolhidos o baço e a medula que são os órgãos onde se encontra um maior número de células plasmáticas que produzem anticorpos. A partir destes órgãos, procedeu-se à extração de ARN usando o reagente Tri. A partir do ARN extraído foi possível sintetizar a primeira cadeia de ADN. O cADN sintetizado foi utilizado para a construção de bibliotecas imunes de pequenos domínios de anticorpos específicos para o recetor CD20, através da amplificação por PCR das famílias de cadeias variáveis leves e pesadas. Esses produtos resultantes da amplificação foram clonados no vetor pComb3x, que é necessário na técnica de phage display, resultando numa biblioteca imune com uma grande diversidade, ideal para este tipo de seleção. Em seguida, as bibliotecas resultantes foram selecionadas através da tecnologia de phage display que permite a seleção de anticorpos específicos para CD20 em células que contenham esse recetor. Esta tecnologia baseia-se na engenharia genética de bacteriófagos e em várias rondas de seleção contra o antigénio e propagação dos fagos. Resumidamente, os fagos vão conter à sua superfície o fenótipo correspondente ao genótipo encapsulado no seu interior que contem a sequência correspondente aos fragmentos de ADN obtidos através da construção das bibliotecas de anticorpos. Seguem-se várias rondas de seleção onde vão sendo eliminados os anticorpos-fagos que não se ligam ou que possuem uma fraca ligação às células que contêm o antigénio, neste caso o recetor CD20, através de várias lavagens. Estas rondas vão sendo repetidas até obtermos uma população de anticorpos específica para o alvo. Para este phage display, foram utilizados 3 tipos de células: células Raji, que está descrito que expressam o CD20, pois são células de linfoma B; células HEK 293T que não expressam CD20 e por isso foram utilizadas para eliminar os anticorpos não específicos para este recetor; células Jurkat, que tal como as anteriores não possuem CD20, pois tratam-se de células T de leucemia aguda e que por isso foram também utilizadas para eliminar anticorpos não específicos. Esta seleção resultou num conjunto de anticorpos-fagos específicos para o recetor CD20, resultado que foi confirmado através de Western Blot. Após a seleção por phage display, foi necessário fazer uma seleção em larga escala para avaliar os anticorpos que melhor eram expressos e que melhor se ligavam ao alvo. Para esta avaliação da expressão foi necessário clonar o ADN resultante dos fagos selecionados por phage display, num outro vetor que permitisse a expressão de proteína, neste caso o vetor pT7-PL. Esta avaliação da ligação e expressão foi feita através de ensaios de ELISA com extrato proteico de células Raji e células Raji. Para além disso, após várias seleções os melhores 10 clones foram sequenciados para avaliar a homologia entre si e verificar os CDRs. Através do alinhamento da sequência de aminoácidos obtida a partir da sequenciação, verificou-se que 9 dos clones eram iguais, restando assim apenas 2 clones. A especificidade dos dois clones selecionados para o recetor CD20 foi avaliada através de Western Blot, sendo que um deles (anticorpo no formato VL) era específico para o recetor pretendido. Estas metodologias levaram à seleção de um anticorpo de pequeno domínio específico para CD20, que devido às suas características únicas e diferentes dos que já existem no mercado poderá ser um promissor candidato para ser usado como agente terapêutico para linfomas de células B que expressem o recetor CD20.