Deteção de vírus em matrizes alimentares

Abstract

A segurança alimentar está relacionada com a presença de perigos em géneros alimentícios no momento do seu consumo. A entrada desses elementos perigosos que podem constituir um risco quando ingeridos em conjunto com o alimento contaminado pode ocorrer em qualquer etapa da cadeia de produção de alimentos, tornando-se essencial a sua conveniente identificação. Os perigos biológicos de origem alimentar incluem microrganismos como fungos, bactérias e vírus. Os vírus são parasitas intracelulares obrigatórios que contêm um genoma de RNA ou de DNA associado a uma capa proteica protetora. Apenas se conseguem multiplicar no interior das células vivas dos seus organismos hospedeiros após infeção. A contaminação de alimentos por vírus pode ocorrer ao longo de toda a cadeia de produção, quer devido ao uso de más práticas de saneamento ou à intervenção de manipuladores de alimentos infetados. Entre os alimentos com maior risco de contaminação por vírus entéricos estão os moluscos bivalves, devido à sua elevada capacidade de filtrar e concentrar os vírus que podem estar presentes na água, os vegetais, legumes, frutos vermelhos e bagas cultivados em campos fertilizados com resíduos de origem animal ou irrigados com águas contaminadas. Nestes alimentos contaminados, os vírus estão geralmente presentes em baixas concentrações e as metodologias de deteção convencionais, tais como a propagação em células animais, nem sempre permitem a sua deteção. Para além do mais, nem sempre existem métodos de rotina para a propagação de certos vírus. A sua deteção passa, portanto, pela utilização de técnicas moleculares após as necessárias etapas de extração de partículas virais da matriz em questão e subsequente extração de ácidos nucleicos virais. A presente dissertação de mestrado teve como principal objetivo o desenvolvimento de novos métodos e a adaptação e otimização de métodos previamente descritos para a deteção de vírus em diferentes matrizes alimentares relevantes. Este trabalho permitiu definir métodos específicos de deteção de norovírus GI, norovírus GII, vírus da hepatite A, e adenovírus humanos (HAdV) por RT-PCR e PCR em tempo real. Para os métodos desenvolvidos foi determinado o limite de deteção (LOD), a especificidade e a reprodutibilidade em diferentes termocicladores. Este trabalho permitiu igualmente otimizar o processo de extração de ácidos nucleicos virais após a extração de partículas virais de diferentes vírus a partir das seguintes matrizes alimentares selecionadas: moluscos bivalves, frutos vermelhos e águas engarrafadas. Os métodos desenvolvidos estão prontos para serem usados numa empresa sob a forma de kit ou serviço. Em paralelo, este trabalho permitiu igualmente o desenvolvimento de um método de PCR digital que permite a deteção e quantificação em simultâneo de 69 serótipos de HAdV descritos.

Food safety is related to the presence of hazards in food at the time of consumption. The entry of these dangerous elements that may pose a risk when taken in combination with the contaminated food can occur at any stage of the food production chain, making it essential their convenient identification. Biological hazards include foodborne microorganisms such as fungi, viruses and bacteria. Viruses are obligate intracellular parasites that contain an RNA or DNA genome associated to protein.. They can only multiply within living cells after infection of their host organisms. The food contamination by viruses may occur throughout the food chain either by use of poor sanitation practices or by the intervention of infected food handlers. Among the foodstuffs with higher risk of contamination by enteric viruses are bivalve molluscs, due to their high ability to filter and concentrate viruses that may be present in the water, and vegetables and berries cultivated in fertilized fields with waste of animal origin, or irrigated with contaminated water. In contaminated food, viruses are usually present in low concentrations and conventional detection methodologies, such as propagation in animal cells, do not always allow their detection. Furthermore, there are not routine methods for the propagation of certain viruses. Therefore, their detection requires the use of molecular techniques after the necessary steps of virus extraction and subsequent extraction of viral nucleic acids. This master's thesis had as main objective the development of new methods and adaptation and optimization of previously described methods, for virus detection in different relevant food matrices. This work allowed defining specific methods for the detection of norovirus GI, norovirus GII, hepatitis A virus and human adenoviruses (HAdV) by real-time RT-PCR and PCR. For the developed methods, the limit of detection (LOD), the specificity, and the reproducibility, were determined. This work also allowed the optimization of the process of extraction of viral nucleic acids after their isolation from the following selected food matrices: bivalve molluscs, berries and bottled water. The developed methods are ready to be marketed as commercial kits or in form of a service. This work also allowed the development of a digital PCR method that allows the detection and the quantification of 69 HAdV serotypes.