Generation and characterization of a Cerl2-KO embryonic stem cell line

Abstract

Até aos dias de hoje, a Embriogénese é considerada um dos mecanismos mais fascinantes e complexos de decifrar. Os processos que medeiam a origem, desenvolvimento e especialização de um oócito até este formar um organismo completo são exaustivamente estudados de forma a entender a origem das doenças congénitas. Nos vertebrados, o coração é o primeiro órgão a ser formado tendo a funcionalidade de bombear o sangue e, desta forma, suprimir as constantes necessidades nutritivas do embrião. Por detrás da sua formação, várias vias de sinalização moleculares necessitam de estar intimamente relacionadas entre si. A mais pequena alteração numa delas leva ao surgimento de doenças cardíacas congénitas, afetando desde à nascença a qualidade de vida do Ser vivo. Deste modo, é crucial que sejam decifrados os mecanismos e moléculas por detrás da origem destas doenças, culminando na descoberta de terapias específicas bem como na sua prevenção. Durante o desenvolvimento embrionário, são vários os mecanismos que determinam o correto posicionamento do coração através da origem sequenciada dos três eixos principais: o Anterior-Posterior (A-P), o Dorso-Ventral (D-V) e o Esquerdo-Direito (E-D). Este último, está implicado na definição do posicionamento do coração na caixa torácica, na sua rotação final bem como na correta morfologia dos ventrículos e aurículas. Uma das principais vias de sinalização que inicialmente medeia a diferenciação da mesoderme e o estabelecimento do eixo E-D é a via Nodal, integrante da família TGF-β composta por vários outros membros também fatores de crescimento. No ratinho, nas etapas iniciais, as proteínas Nodal deslocam-se assimetricamente para o lado esquerdo do nó, uma estrutura embrionária transiente, e aí interagem com várias proteínas antagonistas capazes de direcionar o seu fluxo para a Placa Lateral Esquerda da Mesoderme. Quando se verifica uma mutação em algum dos genes codificadores destas proteínas antagonistas do Nodal, a indução da sua cascata de sinalização é rapidamente afetada resultando em defeitos de lateralidade dos órgãos, nomeadamente do coração e das suas artérias. Nas últimas décadas, vários modelos animais e celulares têm sido usados para mimetizar o fenótipo e genótipo característico de algumas patologias cardíacas humanas resultantes de anomalias de lateralidade. Nomeadamente, ratinhos knockout para o gene Cerberus-like 2 (Cerl2) foram anteriormente desenvolvidos de forma a estudar as implicações por detrás da perda de função deste gene. Este mesmo gene é expresso assimetricamente no lado direito do nó, codificando a proteína Cerl2 identificada como uma relevante antagonista da via de sinalização Nodal. Aquando a ausência da sua atividade antagonista, verifica-se uma anormal ativação da sinalização Nodal também na Placa Lateral Direita da Mesoderme. Tendo em conta as suas funções moleculares, seria de esperar que os ratinhos mutantes apresentassem fenótipos de lateralidade anormal. Deste modo, foram descritos defeitos na orientação do eixo cardíaco (looping randomizado), falhas na formação do septo ventricular e auricular, transposição das grandes artérias, hipertrofia ventricular, entre outros. Ainda, verificou-se uma taxa de morte neonatal considerável, no primeiro dia após o nascimento, tendo sido estabelecida uma relação direta entre a perda de função deste gene e o fenótipo mortal nestes ratinhos. No entanto, entre a população de ratinhos knockout foram identificadas ligeiras diferenças nos fenótipos apresentados, sendo alguns livres de malformações no estabelecimento do eixo E-D. Posteriormente, estudos de eletrocardiografia realizados a embriões e ratinhos neonatais Cerl2-/- permitiram estudar a eletrofisiologia e morfologia dos seus corações. De forma a ser independentemente estudado o mecanismo de ação molecular do Cerl2, foram considerados apenas ratinhos sem fenótipo anormal de lateralidade. Os resultados revelaram um aumento do índice de massa ventricular esquerda, uma redução do pico de velocidade da artéria pulmonar e uma diminuição do ritmo cardíaco, comparativamente com a população wild-type. Com o intuito de desvendar o papel deste gene, foram realizadas análises histológicas a amostras de corações em diversas fases de desenvolvimento embrionário e fetal. O estudo revelou um aumento significativo da espessura do miocárdio constituinte do ventrículo esquerdo demonstrando ainda que este fenómeno se deve a hiperplasia dos cardiomiócitos, com um aumento associado do número de eventos mitóticos. Verificou-se, ainda, um aumento dos níveis de fosforilação Smad2 sugerindo que a via de sinalização Nodal/Activin/Smad2 poderá estar super estimulada na ausência de proteínas Cerl2. Salientando, esta via de sinalização foi identificada como uma das principais reguladoras do processo de cardiogénese. No presente projeto, com o objetivo de analisar o papel do Cerl2 no processo de cardiomiogénese, células estaminais embrionárias foram derivadas de blastocistos dos ratinhos knockout. Foram usados os protocolos chave para a confirmação da estabilidade e propriedades de pluripotência das células geradas, podendo posteriormente ser usadas como um modelo de doença fiável. Análises ao cariótipo demonstraram que as linhas celulares derivadas apresentam estabilidade cromossómica, tanto a nível numérico como estrutural. Ao recorrer à técnica de imunofluorescência as células Estaminais Embrionárias revelaram marcação positiva para os marcadores NANOG, OCT4 e SSEA1 indicando a existência de expressão proteica dos mesmos. Corroborando estes resultados, níveis de expressão génica positivos foram identificados através da técnica de PCR quantitativo em tempo real (RT-PCR). Assim, foram amplificadas de forma significativa, amostras da sequência genética de Nanog, Oct4 e Sox2, revelando uma vez mais a existência de propriedades de pluripotência. De forma a demonstrar a capacidade de diferenciação em todas as linhagens celulares que compõem um organismo, procedeu-se à diferenciação espontânea das células Estaminais Embrionárias Cerl2-/- através do método de cultura de Corpos Embrióides (EBs). Recorrendo uma vez mais a testes de imunofluorescência, verificou-se a capacidade de diferenciação nas três camadas germinativas – endoderme, mesoderme e ectoderme – através da presença de marcadores proteicos específicos para cada uma delas. Usando o protocolo de diferenciação cardíaca por EBs, testou-se a hipótese de nas células estaminais Cerl2-/- a capacidade de diferenciação na mesoderme estar aumentada, comparativamente com células estaminais controlo (linha comercial E14). Observou-se um aumento substancial da capacidade de adesão, às placas de cultura, dos EBs derivados da linha mutante. Constatou-se, o surgimento de regiões com atividade cardíaca nos EBs knockout a partir do dia 6 de diferenciação, enquanto nos EBs derivados da linha wild-type estas regiões com contratilidade cardíaca apenas eram visíveis a partir dos dias 7 ou 8 de diferenciação. Durante este processo, foram contabilizadas as áreas de contratilidade verificando-se que, em média, no dia 10 do protocolo de diferenciação, cada EB knockout continha o dobro do número de áreas comparativamente com um EB da linha controlo. Estudando as variações temporais da expressão de genes característicos das várias etapas de diferenciação desde a mesoderme até à formação de cardiomiócitos maduros, através de RT-PCR, verificou-se um aumento da expressão de Mesp-1, Isl1 e Nkx2.5 indicando um incremento no número de células progenitoras cardíacas geradas. Analisando os níveis de expressão de genes implicados na maturação dos cardiomiócitos, verificou-se um aumento da regulação de α-MHC e uma diminuição na regulação de cTnT nas células diferenciadas Cerl2-/-. Conclui-se que as células KO têm uma maior capacidade de diferenciação mesodérmica, levando à produção de um maior número de progenitores cardíacos e, consequentemente, a um aumento no número de cardiomiócitos gerados. No entanto, estes aparentam ter uma maturação incompleta. Em conclusão, os resultados desenvolvidos neste projeto possibilitaram o estabelecimento e caracterização de linhas estaminais Cerl2-/- de ratinho servindo estas como um modelo para estudar as patologias congénitas relacionadas com este gene. Foram reveladas as primeiras descobertas sobre as alterações nos mecanismos de cardiomiogénese resultantes da perda de função do gene Cerl2. Futuramente, poderão ser usadas como ferramenta para a descoberta de novos mecanismos biológicos das proteínas Cerl2 ou mesmo até para o desenvolvimento de terapias celulares.

Embryogenesis is a well-organized process capable of originating the complex mammalian organisms. Even a slight change in the signaling pathways is capable of significantly altering the biological mechanisms leading to a mutant phenotype. The heart is the first organ to be formed during this process, according to its vital functions since the first days of an embryo’s life throughout the entire life of the mammalian organism. Sporadically, cardiogenesis does not occur with the normal coordination and some signaling pathways are altered resulting in congenital heart diseases. Thus, it is crucial to uncover the molecular and morphogenetic mechanisms that lead to these pathologies in order to discover new therapies’ insights and provide genetic prevention. A Cerberus/Dan family member, the mouse Cerberus-like 2 (Cerl2) gene, has been studied and identified as a Nodal antagonist, capable of interfering in the most relevant steps during Left-Right (L-R) axis establishment that lead to the asymmetric patterning of the heart. Its function consists to spatially regulate Nodal proteins to the Left Lateral Plate Mesoderm, at the embryonic stage of development. In Cerl2 knockout mice, it was reported a wide range of laterality defects with associated cardiac failure and significant death rate on the first day after birth. Previously, a massive increase of the ventricle walls was observed as a consequence of cardiomyocytes’ hyperplasia, verified by an increase in their mitotic index. In order to uncover the possible roles of Cerl2 in the regulation of the signaling pathways underlying cardiomyocyte proliferation and differentiation, three Cerl2-/- Embryonic Stem cell (ES cell) lines were derived from blastocysts of the mutant mice. Using this disease model, it was possible to begin the study of the implications of Cerl2 in the spatiotemporal control of cardiac progenitors’ proliferation and its differentiation into mature cardiomyocytes. Firstly, the normal chromosomic number and structural stability of the derived lines was confirmed by G-banding staining. Then, pluripotency properties were verified using standard protocols, such as immunofluorescence microscopy that demonstrate positive protein expression for NANOG, OCT4 and SSEA1 markers. Also, through real-time amplification of endogenous RNA expression for Nanog, Oct4 and Sox2 genes it was confirmed the presence of pluripotency properties. In order to prove the differentiation capacity in the three germ layers, the ES cells were spontaneously differentiated and positive protein expression for endoderm, mesoderm and ectoderm was confirmed through immunostaining. Using the Embryoid Bodies culture, the Cerl2-/- ES cells were differentiated into cardiac cells. It was notorious a significant change in the number of produced beating foci areas compared to the control line: the knockout cells originated the double of the cardiac foci compared to the wild type cells, even at day 10 of the differentiation protocol. Using the real-time PCR technique, the levels of early cardiac genes expression were studied, showing a statistical upregulation of Mesp-1, Nkx2.5 and Isl1 genes in the differentiated Cerl2-/- cells. Also, the expression of mature cardiac markers was evaluated resulting in increased levels of α-MHC and reduced levels of cTnT in these cells. Concluding, loss-of-function of Cerl2 leads to a possible increase in the cardiac progenitor cells resulting in a higher number of derived cardiomyocytes. However, despite of showing early beating actions they did not reveal a complete maturation. Ultimately, the present project uncovers the first insights in the Cerl2 role during mouse cardiomyogenesis, mainly in the specification of the number of cardiomyocytes that will populate the mature myocardium.