Analysis of neutrophil recruitment during tissue regeneration in zebrafish models of human disease

Abstract

Inflammation is an essential process of an organisms’ response to assault, preventing infection and promoting tissue repair. Neutrophils are the first leukocytes to be recruited, arriving in large numbers a few hours after injury. Having been considered both indispensable for proper resolution of inflammation but a hindrance to wound healing, their role requires further study. Diabetes mellitus (DM) is a worldwide public health concern that is characterized by chronic elevated fasting blood glucose levels (hyperglycemia), usually caused by deficient production of insulin or developed resistance to insulin. Prolonged hyperglycemia has been associated with many disease complications like the diabetic foot, which is in part caused by impaired wound healing associated with chronic inflammation. DM models in zebrafish (Danio rerio), an animal model renowned for its regenerative capabilities, display impaired regeneration of the caudal fin (Olsen et al., 2010). Therefore, we aimed first to study neutrophil recruitment during impaired caudal fin regeneration in a DM zebrafish model, and address whether it differed from what occurred under normal conditions. Due to animal welfare concerns and most importantly, to the high inconsistency of the glycemic outcome among the tested animals, we were unable to establish a reliable DM model in our lab. As such, neutrophil recruitment during zebrafish caudal fin regeneration was only characterized in healthy animals of the Tg(mpx:GFP) transgenic line through widefield fluorescence microscopy. Under normal conditions, we observed an early influx of neutrophils at 6 hours after amputation. Neutrophil recruitment was further reduced by 1 day after amputation, when the number of neutrophils at injured fin returned to basal levels. This recruitment pattern was consistent with the early role of neutrophils during inflammation. However, our data contrasted with the findings by Petrie et al. (2015) that only observed a peak of neutrophil recruitment at 3 days after amputation. Diabetes mellitus has also been shown to be associated with cardiovascular diseases, such as myocardial infarction (MI). This cardiovascular pathology is a major source of mortality and disability, due to the inability of humans to regenerate the damaged heart tissues forming non-contractile scar tissue instead. Importantly and like other pathological conditions, myocardial infarction is also associated with an inflammatory process. Little is still known about the enrollment and the role of neutrophils after MI. In mouse models of MI, neutrophils have been shown to be recruited to the infarcted area (Ma et al., 2016). As no study so far has addressed the recruitment of neutrophils in zebrafish MI models, the second aim in this work was therefore to investigate this issue in adult animals by analyzing immunolabeled heart cryosections with widefield fluorescence microscopy. From our results, a marked neutrophil recruitment to the infarcted area was observed at an early time-point of 6 hours after injury and was further maintained at high levels up to 1 day after injury. By 3 days the quantity of neutrophils at the injury seemed to have been reduced and this reduction was even more striking by 7 days after injury. As observed in inflammatory processes associated to other biological contexts, a higher influx of neutrophils to the injury was thus evidenced at early time-points after MI in adult zebrafish. Overall, these results have provided a first insight on the enrollment of neutrophils in the inflammatory and regenerative processes following MI in zebrafish, and thus contributed to a better understanding of the role of these leukocytes in these processes. Altogether, the neutrophil recruitment patterns observed after amputation of the caudal fin as well as after myocardial infarction are consistent with the early role of neutrophils during the inflammatory phases of both zebrafish regenerative processes. This leads us to suggest that despite all controversies neutrophils should, at least in zebrafish, play a role in tissue regeneration.

A resposta inflamatória é um processo essencial do organismo na sua defesa face a agressões, protegendo contra infeções e estimulando o processo de reparação dos tecidos. Quando as células imunitárias residentes nos tecidos detetam agressões ou agentes patogénicos libertam sinais que desencadeiam a resposta inflamatória, começando por aumentar o fluxo sanguíneo para a área afetada. Os neutrófilos são o primeiro tipo de leucócitos a ser recrutados, começando a acumular-se na área cerca de 6 horas após o dano. Eles fagocitam agentes patogénicos e células necróticas, libertando também substâncias antimicrobianas para o meio extracelular. Este influxo inicial de neutrófilos é posteriormente seguido pelo recrutamento de monócitos em circulação, que no foco de inflamação se diferenciam em macrófagos que apresentam maior capacidade fagocitária que os neutrófilos. A resolução da inflamação envolve o início da apoptose dos neutrófilos e sua consequente eliminação mediada por fagocitose pelos macrófagos. Estes processos contribuem para uma mudança fenotípica nos macrófagos que lhes confere uma função anti-inflamatória e de pro-resolução que estimula a reparação tecidual e a recuperação da homeostasia do organismo. A reparação dos tecidos pode ter três resultados: reparação com cicatrização mínima, formação de cicatriz, ou regeneração dos tecidos. Todos começam com uma resposta inflamatória e formação de um tecido de granulação, rico em fibroblastos e capilares sanguíneos. Na formação de cicatriz o tecido fibrótico provisório é substituído por uma matriz permanente de colagénio, conduzindo à perda de função, total ou parcial, do tecido. Para ocorrer regeneração, é necessária a formação de um blastema, uma massa proliferativa de células indiferenciadas capaz de se re-diferenciar quando chegam ao seu local de destino. O papel da resposta inflamatória na reparação e regeneração de tecidos ainda não está totalmente esclarecido, existindo dados contraditórios. Por um lado, a depleção de neutrófilos em ratinho leva a uma reparação mais rápida dos tecidos (Dovi, et al., 2003); por outro lado, na salamandra a resposta inflamatória é indispensável para regenerar a lente ocular após dano (Kanao and Miyachi, 2006). O peixe-zebra (Danio rerio) constitui um modelo animal único pois permite o estudo da resposta inflamatória durante a regeneração de tecidos. O seu sistema imunitário é equivalente ao dos mamíferos, e este peixe tem capacidade de regenerar quase todas as partes do seu corpo como barbatanas, o coração e a espinal-medula. O peixe-zebra é também um modelo animal para o qual um grande número de linhas transgénicas têm vindo a ser criadas ao longo dos últimos anos nas quais diversos tipos celulares são especificamente marcados com proteínas fluorescentes, como por exemplo neutrófilos, macrófagos e cardiomiócitos. A diabetes mellitus é uma doença que afetava cerca de 366 milhões de adultos mundialmente em 2011. É caracterizada por uma elevação crónica dos níveis de glicose no sangue (hiperglicemia) em jejum. Pode ser causada quer por produção insuficiente de insulina (Tipo 1) quer por desenvolvimento de resistência à insulina (Tipo 2). Independentemente da causa, a hiperglicemia prolongada pode levar a danos a longo prazo mesmo após reestabelecer níveis normais de glicémia. Uma das várias complicações patológicas secundárias é por exemplo o pé diabético, para a qual contribuem uma deficiente capacidade de reparação e cicatrização tecidual e a inflamação crónica evidenciada em indivíduos diabéticos. Da mesma forma já foi demonstrado que modelos de diabetes em peixe-zebra apresentam um efeito secundário semelhante, evidenciando por exemplo problemas na regeneração da barbatana caudal (Olsen et al., 2010). Com o objetivo de analisar o recrutamento de neutrófilos durante a regeneração comprometida da barbatana caudal num modelo de diabetes de peixe-zebra, seria primeiro necessário estabelecer o modelo diabético na Zebrafish facility no iMM-JLA. Dois protocolos diferentes foram testados para este fim: injeção da droga diabetogénica estreptozocina, que especificamente destrói as células produtoras de insulina; e imersão dos peixes numa solução de glicose, para indução de hiperglicemia por absorção de glicose do meio. Mas nenhum dos protocolos apresentou resultadossuficientemente consistentes para poderem ser considerados fiáveis na indução de hiperglicemia nos nossos peixes-zebra. Para além disso, muitos dos animais injetados com estreptozocina apresentaram efeitos secundários graves. Assim, o recrutamento de neutrófilos durante a regeneração da barbatana caudal foi apenas analisado em animais saudáveis pertencentes à linha transgénica Tg(mpx:GFP) por microscopia de fluorescência de campo largo. Os peixes desta linha apresentam neutrófilos que expressam especificamente a proteína GFP (Proteína Fluorescente Verde) e permitindo a sua observação específica com recurso a microscopia de fluorescência. Uma análise semelhante havia sido previamente publicada por Petrie et al. (2014), em que se observou um crescente recrutamento de neutrófilos que atingia o seu pico aos 3 dias após a amputação. É de salientar que os nossos resultados diferem destes, uma vez que observámos um influxo inicial de neutrófilos para a ferida às 6 horas após a amputação, com a densidade de neutrófilos na ferida e na zona regenerada a voltar a níveis fisiologicamente normais ao fim de 1 dia após a amputação. A diabetes está também intimamente associada ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como os enfartes do miocárdio. Esta patologia cardíaca em particular é uma das maiores causas de mortalidade e incapacidade no mundo, face à incapacidade dos humanos em regenerar o tecido necrótico formando antes uma cicatriz não contráctil no tecido cardíaco. Como qualquer outro estímulo danoso ao organismo o enfarte desencadeia uma resposta inflamatória. Esta é seguida pela formação de um tecido granuloso fibrótico que nos mamíferos é posteriormente substituída por uma cicatriz rica em colagénio, e no peixe-zebra dá lugar a novo tecido cardíaco. Em relação à resposta inflamatória associada, modelos de enfarte do miocárdio em ratinho permitiram anteriormente observar um significativo recrutamento de neutrófilos para a zona de enfarte, leucócitos que habitualmente estão ausentes do tecido cardíaco (Ma et al., 2016). Neste estudo observou-se uma concentração máxima de neutrófilos ao final de um dia após lesão, que embora diminuindo a partir desta altura, se manteve em níveis ainda significativamente altos aos 7 dias após a lesão. Para além deste estudo a literatura publicada sobre o recrutamento de neutrófilos após enfarte do miocárdio é impressionantemente escassa. Como tal, o nosso segundo objetivo foi analisar o recrutamento dos neutrófilos durante a resposta inflamatória induzida pelo enfarte do miocárdio em peixe-zebra. Neste trabalho, o enfarte foi induzido na linha transgénica Tg(mpx:GFP) por crio-lesão após exposição do ventrículo. Para se determinar se a incisão efetuada para a exposição do ventrículo influenciava o recrutamento de neutrófilos foram utilizados peixes controlo da ferida, nos quais apenas se procedeu à exposição do ventrículo. Para aquisição dos dados de recrutamento recorreu-se ao tratamento histológico dos corações, os quais foram incluídos em Optimal cutting medium (OCT), congelados, cortados a frio e montados em lâminas de vidro. Os cortes obtidos foram posteriormente submetidos a diferentes procedimentos. Parte destes foram corados com hematoxilina e eosina para visualização da estrutura tecidual por microscopia de campo claro. Com os restantes a serem submetidos a marcação por imunohistoquímica com anticorpos específicos para a deteção do GFP presente nos neutrófilos e outros componentes cardíacos sendo as imagens dos mesmos adquiridas por microscopia de fluorescência de campo-largo para posterior análise. Um script de Matlab foi posteriormente utilizado para analisar o recrutamento de neutrófilos observado nas imagens de fluorescência adquiridas. Globalmente, a análise das imagens adquiridas revelou um recrutamento de neutrófilos mais pronunciado às 6 horas e 1 dia após o enfarte, que diminuiu significativamente aos 3 e 7 dias após lesão. Contrariamente ao observado em ratinho, observámos um número substancialmente reduzido de neutrófilos presentes na área afetada nos dias mais tardios. A reduzida presença de neutrófilos nos corações dos peixes de controlo da ferida permitiu ainda determinar que o recrutamento observado nos corações submetidos à crio-lesão era devido este dano e não à lesão efetuada para expor do ventrículo. No geral, os resultados preliminares obtidos neste trabalho permitiram confirmar o recrutamento inicial de neutrófilos durante a regeneração do coração após enfarte do miocárdio em peixe-zebra. Em suma no presente trabalho foi possível concluir que no peixe-zebra, tanto na resposta regenerativa à amputação da barbatana caudal como no enfarte do miocárdio, se observaram padrões de recrutamento de neutrófilos para as lesões consistentes com a função destes leucócitos no início dos processos inflamatórios associados. Estes resultados levam-nos a sugerir que pese embora a controvérsia que envolve a sua atuação na regeneração os neutrófilos devam, pelo menos no peixe-zebra, desempenhar uma função relevante neste processo fisiológico.