Development of novel bacterial enzymes for medical diagnosis through directed evolution

Abstract

Pyranose 2-oxidases (P2Oxs) have a great potential to replace the typical glucose oxidases (GOxs) and glucose dehydrogenases (GDHs), specific for β-D-glucose anomer, in glycemia monitoring biosensors. P2Oxs are flavoenzymes mostly identified in Fungi that catalyzes the regioselective oxidation of C2 alcohol moiety of several aldopyranoses originating the correspondent keto-sugar with the concomitant reduction of O2 to H2O2. The use of O2 as cheap and clean oxidant and in particular the lack of D-glucose anomer preference represent very attractive points for the biotechnological application of P2Oxs. In this work, directed evolution (DE) methodologies were applied to improve the first identified bacterial P2Ox, from Pseudoarthrobacter siccitolerans, AsP2Ox, in its specificity and activity for D-glucose. This strategy was supported by transient-state analysis in combination with oxygen consumption steadystate kinetics showing that the reductive half-reaction (oxidation of D-glucose) is the limiting step of the catalytic mechanism. We first optimized and validated colorimetric screening enzymatic assays based on ‘activity-on-plate’ and 96-well plates using cell crude extracts. These screenings allowed analyze in a high-throughput mode, thousands of variants generated by error-prone PCR. The hit variant from the first-generation 1A1 harbors only one mutation, G366S, located close to the substrate binding site. Biochemical and kinetic analysis using purified enzyme showed that 1A1 has a 2-fold increased kcat (turnover number) and 2-fold higher protein production yields as compared with the wild type enzyme. In a second round of directed evolution a new hit variant 5D5 was selected, carrying four additional mutations (S22S, A75T, A206T, Q295H). The pH profile of 5D5 revealed an optimum pH shifted 1 unit towards the alkaline range, a 6-fold higher kcat and 3-fold production yields than the wild-type enzyme. The analysis of mutations using site-directed mutagenesis showed that both G366S and Q295H are key mutations, which under an epistatic effect contributed to the higher catalytic efficiency exhibited by 5D5 hit variant. The comparison of kinetic parameters of 5D5 variant with GOxs and GDHs show that its Km remains too high and the kcat too low in order to replace the traditional enzymes in biosensors. Therefore, the evolution of AsP2Ox must continue using 5D5 as the parent in new rounds of DE to achieve an improved variant exhibiting the properties that fit the desired application.

Piranoses 2-oxidases (P2Oxs) são enzimas que oxidam açúcares, nomeadamente D-glucose, no carbono C2, o que representa uma vantagem na substituição das atuais enzimas usadas em biossensores para monitorização da glicemia, as glucose oxidases (GOxs) e glucose desidrogenases (GDHs), que apenas oxidam no carbono C1, o anómero β-D-glucose. Como consequência, o uso das P2Oxs em biossensores poderá conduzir a uma medição mais sensível dos níveis de D-glucose no sangue. As P2Oxs são flavoenzimas que foram identificadas maioritariamente em fungos com funções relacionadas com a degradação da biomassa vegetal. Estas enzimas catalisam a oxidação seletiva do grupo álcool do carbono C2 de diversas aldopiranoses originando as respetivas ceto-piranoses. Como aceitador de eletrões, estas enzimas podem utilizar um vasto repertório de moléculas (como quinonas e radicais) mas a sua grande vantagem reside na utilização de oxigénio molecular, que é um oxidante barato e “limpo”, que é reduzido a peróxido de hidrogénio durante o seu ciclo catalítico. Este divide-se em duas semirreações, uma redutiva, relacionada com a redução do cofator FAD a FADH2 em consequência da oxidação do carbono C2 dos açúcares libertando como produto, o respetivo cetoaçúcar, e uma oxidativa, associada à reoxidação do FADH2 a FAD, na presença de um aceitador de eletrões, como o dioxigénio. Atualmente, para além das P2Oxs fúngicas, três P2Oxs de origem bacteriana foram caracterizadas entre as quais se destaca a AsP2Ox, da bactéria Pseudoarthrobacter siccitolerans por ter sido a primeira e cuja identificação foi realizada no laboratório de Tecnologia Microbiana e Enzimática do ITQB NOVA. A caracterização desta enzima revelou, no entanto, uma baixa afinidade para a D-glucose. Assim, este trabalho de dissertação teve como principal objetivo a aplicação de técnicas de evolução dirigida (DE) para melhorar a enzima AsP2Ox de modo a aumentar a sua especificidade e atividade para o uso da Dglucose como substrato de modo a que possa ser empregue em biossensores de monitorização da glicemia. Esta estratégia de engenharia foi eleita, uma vez que a ausência de uma estrutura cristalina da enzima ou de um modelo estrutural fidedigno, não é possível fazer previsões de melhoramento racional baseado em relações entre a estrutura e a função. A engenharia de enzimas por Evolução Dirigida requer a otimização de um número de parâmetros desde o crescimento das estirpes recombinantes, métodos de rutura celular até ao rastreio de atividade enzimática. Neste trabalho desenvolveu-se, otimizou-se e validou-se duas metodologias para rastreios em larga escala (high-throughput screenings) que possibilitaram a análise de alguns milhares de variantes gerados por error-prone PCR nas duas gerações de evolução dirigidas efetuadas. Uma das metodologias utilizou como alvo colónias de células em placa de Petri (‘activity-on-plate’) e outra, extratos celulares brutos, após crescimento das colónias em meio líquido em placas com 96 poços. Uma das otimizações realizadas foi no método de deteção da atividade enzimática da AsP2Ox. Sendo o oxigénio molecular o aceitador final de eletrões pretendido, a atividade da enzima é medida através de uma reação acoplada utilizando uma peroxidase (e.g. Horseradish peroxidase, HRP), que consume o peróxido de hidrogénio formado pela AsP2Ox e oxida um substrato que origina um produto corado, cuja formação possa ser facilmente monitorizada num espectrofotómetro. Provou-se que o ABTS, substrato da HRP mais comumente utilizado neste tipo de reações acopladas, levava a medições subestimadas de atividade da AsP2Ox. Por conseguinte, testou-se um novo sistema de substratos baseado em dois compostos (AAP e DCHBS) que, por atividade da HRP e na presença de H2O2 origina um composto cor-de-rosa, doseado espetrofotometricamente a 515 nm que se revelou um método mais adequado para seguir a atividade da AsP2Ox. As biblioteca de variantes geradas por “error-prone PCR” foram rastreadas num primeiro passo através da metodologia ‘activity-on-plate’, que sendo qualitativa, permitiu identificar clones com atividade e diminuir o número de variantes a serem avaliados com maior rigor. O segundo screening, em placas de 96 poços, com carácter quantitativo, necessitou de ser exaustivamente otimizado de modo a diminuir o risco de se selecionar falsos positivos. Assim, observou-se que o uso da estirpe KRX de E. coli como estirpe de expressão da proteína de interesse, em placas de 96 poços de poços fundos e consequente disrupção dos pellets celulares recorrendo a lisozima era a combinação que conduzia a um coeficiente de variação (CV) para a atividade total da AsP2Ox menor, sendo por isso, aplicado na avaliação dos variantes selecionados por ‘Activity-on-plate’. Na primeira geração de DE, dos 7300 variantes analisados em ‘Activity-on-plate’, cerca de 100 foram inoculadas em placas de 96 poços de poços fundos e sujeitos a screenings, o que permitiu a identificação de um variante, 1A1, que continha uma mutação na posição 366 (glicina para serina), a cerca de 10 Å do N5 do cofator FAD e cuja atividade relativa ao wild-type era de 3.7 } 0.9 (em extratos celulares brutos). Posteriormente, numa segunda geração de DE, dos cerca de 900 variantes pré-selecionados para análise em placa de 96 poços, um, denominado de 5D5, apresentou atividade enzimática melhorada obtendo uma atividade relativa ao parente (1A1) de 5.0 } 0.9. Os resultados da sequenciação do variante 5D5 revelaram a existência de 4 mutações adicionais, sendo uma delas sinónima (S22S), duas localizadas na superfície da enzima (A75T e A206T) e uma (Q295H) dentro da suposta cavidade de ligação ao substrato distando cerca de 11 Å do N5 da molécula de FAD. A análise dos dois variantes obtidos durante a DE, após crescimento em escala grande e purificação, revelou que 1A1 apresenta um aumento nos níveis de produção da enzima (cerca de duas vezes) assim como do parâmetro kcat de duas vezes quando comparado com o wild-type. Já o mutante da segunda geração, 5D5, mostrou um desvio do pH ótimo de 7.5 para 8.5, um ligeiro aumento na produção de proteína funcional, e uma melhoria notória do kcat 6 vezes superior em relação ao wild-type, apresentando uma eficiência catalítica de 3.22 } 0.39 M-1 s-1. De modo a contribuir para o conhecimento sobre o mecanismo catalítico da AsP2Ox utilizou-se um aparelho de stopped-flow para determinar as constantes de segunda ordem das semirreações redutiva e oxidativa da AsP2Ox. Os resultados indicaram que a semirreação redutiva apresenta uma velocidade 6 ordens de magnitude mais lenta do que a semirreação oxidativa, fazendo com que o passo limitante do ciclo catalítico seja a oxidação da D-glucose justificando que o seu melhoramento seja um dos principais objetivos deste trabalho. A técnica de stopped-flow (seguindo a semirreação redutiva) e ainda cinéticas medindo diretamente o consumo de oxigénio num Oxygraph® permitiram ainda suportar os dados de estado estacionário garantindo que a evolução da proteína desde o wild-type até ao variante 5D5 foi bem sucedida. Finalmente, de modo a tentar entender o papel das mutações que foram introduzidas durante o processo evolutivo, recorreu-se à técnica de mutação dirigida para originar os mutantes simples (A75T, A206T e Q295H) e o mutante duplo (Q295H/G366S) que permitiu concluir que as mutações Q295H e G366S, que distam ~7 Å entre si, estão sob um efeito epistático envolvido na melhoria da atividade obtida no variante 5D5, uma vez que o efeito das duas mutações conjuntas é superior ao efeito individual de cada uma das mutações. Adicionalmente, concluiu-se que a mutação Q295H era a responsável pelo desvio de pH ótimo verificado no variante da ultima geração e que as mutações A75T e A206T, embora não desempenhem um papel ativo na melhoria cinética, podem estar relacionadas com os melhores rendimentos de produção proteica obtidos no ultimo variante. Uma comparação dos parâmetros cinéticos (estado estacionário) do último variante obtido, 5D5, com os das GOXs e GDHs, sugere que o Km da AsP2Ox permanece alto e o kcat baixo o que invalida, por enquanto, a sua aplicação em biossensores de rastreio da glicemia, motivando assim o grupo de investigação a continuar a evolução desta proteína, partindo do variante 5D5 como parente para novas rondas de evolução dirigida, de modo a encontrar uma enzima que cumpra os requisitos para a desejada aplicação.