Searching for a new biomarker for Alzheimer's disease based on BDNF receptor cleavage

Abstract

A Doença de Alzheimer (Alzheimer’s disease, AD) é considerada como a causa de demência mais prevalente no mundo (representando 60 a 80% de todos os casos de demência diagnosticados). É uma doença neurodegenerativa progressiva do cérebro, classificada maioritariamente em três fases: uma fase pré-clínica (assintomática), uma fase em que o paciente apresenta danos ligeiros cognitivos (prodrómica) e por fim, demência devido a AD. Em Portugal, como consequência do envelhecimento, aproximadamente 5,9% da faixa etária idosa, com mais de 60 anos, possui demência. Esta patologia possui como principais características a perda neuronal, acompanhada por défices de memória e conduz a uma diminuição do volume do cérebro. A AD é caracterizada, de entre outras alterações moleculares específicas desta patologia, pela hiper-fosforilação da proteína tau (a qual forma fibrilhas) e pela acumulação do péptido Beta Amilóide (Aβ), o qual se agrega em placas amilóides, promovendo danos cognitivos na memória, disfunção sináptica e perda de neuroprotecção endógena. Nesta doença neurodegenerativa, a sinalização mediada pelo fator neurotrófico derivado do cérebro (Brain-derived neurotrofic factor, BDNF) encontra-se desregulada, comprometendo assim funções importantes desempenhadas por este fator em condições fisiológicas, como por exemplo crescimento, diferenciação e sobrevivência neuronais e plasticidade sináptica. É de salientar que foram reportados em cérebros de pacientes de Alzheimer, a diminuição dos níveis de BDNF e do seu recetor tirosina cinase de forma completa (TrkB full-length, TrkB-FL), concomitante com o aumento dos níveis da forma truncada do recetor TrkB (TrkB-Tc), um modulador negativo do TrkB-FL. Estudos recentes investigaram em detalhe o principal mecanismo responsável pela desregulação da sinalização mediada pelo sistema BDNF/TrkB-FL na AD. A acumulação do péptido Aβ, sob condições excitotóxicas, promove uma sobreativação anómala dos recetores N-metil-D-aspartato (NMDA), o que conduz a um aumento dos níveis intracelulares dos iões cálcio (Ca2+). Este aumento anómalo dos níveis intracelulares de Ca2+ promove uma ativação exacerbada das calpaínas (proteases dependentes de cálcio, que em condições fisiológicas possuem um papel fundamental na homeostase e remodelação do citoesqueleto), pelo que desta forma, este processo irá culminar na clivagem do recetor TrkB-FL. Este mecanismo resultante da ação das calpaínas origina dois fragmentos: um recetor truncado ligado à membrana (TrkB-T’) e ainda um fragmento de domínio intracelular (TrkB-ICD). TrkB-ICD é um fragmento estável, que se acumula no núcleo das células ao longo do tempo, através de processos dependentes de fosforilação. Este fragmento possuí um domínio tirosina cinase e promove a fosforilação de proteínas axonais e nucleares. A presença do fragmento TrkB-ICD foi identificada post-mortem em cérebros de pacientes com AD. Além disso, em amostras cortico-temporais post-mortem de pacientes com esta patologia, é possível verificar o aumento significativo dos níveis de TrkB-ICD, ao longo da progressão da doença, acompanhados pelo decréscimo significativo dos níveis proteicos de TrkB-FL. Estudos recentes, ainda não publicados, apontam, através de ensaios in vitro, in vivo e ex vivo, que o TrkB-ICD promove alterações nos perfis transcriptómico e proteómico e promove per se défices de memória e plasticidade sináptica. Notavelmente, de forma a prevenir a clivagem de TrkB-FL, o nosso laboratório criou um novo fármaco, o TAT-TrkB, com potencial benéfico. Estudos efetuados recentemente, por investigadores do nosso laboratório, através de ensaios in vitro demonstram que o TAT-TrkB possui a capacidade de prevenir a clivagem do TrkB-FL em neurónios expostos a Aβ e permite manter a sinalização mediada pelo BDNF funcional, em ensaios ex vivo de plasticidade sináptica e libertação de glutamato. O diagnóstico de AD tornou-se uma área importante com vasta evolução ao longo das últimas décadas. Atualmente, os métodos de diagnóstico disponíveis consistem em biomarcadores do líquido cefalorraquidiano (LCR; também designado por líquor) e marcadores de imagem (como Positron emission tomography, PET e ressonância magnética, MRI). Os biomarcadores do LCR estabelecidos para esta patologia acompanham a evolução da acumulação amilóide, por avaliação da isoforma 1-42 do péptido Aβ (Aβ1-42) e ainda acompanham a evolução neurodegenerativa da tauopatia através da avaliação dos níveis totais da proteína tau (T-tau) e dos níveis da proteína tau fosforilada (p-tau). Estes marcadores, permitem o diagnóstico de pacientes, em conjunto com os sintomas clínicos. Contudo, é crucial encontrar biomarcadores específicos para a AD, que permitam uma deteção da doença numa fase inicial, anterior ao aparecimento de sintomas clínicos, de forma a proporcionar uma maior e melhor qualidade de vida ao paciente. Todavia, até aos dias de hoje, esta constante procura persiste sem sucesso. De uma forma semelhante, as terapêuticas farmacológicas disponíveis para os pacientes com AD são três inibidores de acetilcolinesterase (Donepezilo, Rivastigmina e Galantamina) principalmente indicados para doença ligeira a moderada e um antagonista não competitivo dos recetores NMDA (denominado por Memantina) indicado para doença moderada a severa. No entanto, é preciso considerar que estes fármacos são indicados somente de forma sintomática ou paliativa, pelo que não permitem reverter ou parar a progressão desta patologia. Desta forma, é importante o desenvolvimento de novos fármacos que possam, não só atenuar os sintomas desta patologia, mas também reverter ou parar a progressão desta doença. Todavia, o desenvolvimento de fármacos direcionados ao cérebro para combater esta doença não tem sido bem-sucedido nos últimos anos. Uma limitação para o desenvolvimento destes fármacos é a dificuldade que alguns compostos têm em atravessar a barreira hematoencefálica (BHE). É desta forma importante desenhar compostos com estrutura e características específicas para ultrapassarem esta restrição estabelecida pela barreira, como tamanho, estrutura e carga, permitindo assim que possam chegar ao cérebro onde irão desempenhar a sua função. Os principais objetivos estabelecidos para este projeto foram 1) esclarecer a relevância terapêutica do TAT-TrkB e 2) estudar a relevância dos níveis de TrkB-FL e TrkB-ICD no LCR humano, como possíveis biomarcadores para a AD. Os resultados obtidos neste projeto permitiram demonstrar que o TAT-TrkB é um péptido capaz de atravessar a BHE, translocando cerca de 53% após 24h de incubação, de uma forma eficaz sem comprometer a integridade da barreira. Além disso, após incubação de TAT-TrkB (5 µM) em culturas de neurónios corticais, foi possível verificar que o péptido foi internalizado pela membrana celular dos neurónios, ao longo do tempo. Foi ainda possível observar a presença do fluoróforo fundido a este péptido após 26h de incubação, sugerindo que o fluoróforo e o péptido não foram degradados durante esse período. Através da avaliação da memória espacial e de défices cognitivos, estimada pelo teste de Y-MAZE na versão que contabiliza as alternâncias espontâneas corretas realizadas pelos animais, os resultados permitiram inferir que a administração intraperitoneal de TAT-TrkB (25 e 50 mg/kg) não promoveu danos cognitivos tanto no modelo animal de AD (5xFAD), como nos animais controlo. Relativamente à avaliação dos níveis de TrkB-FL e TrkB-ICD no LCR de pacientes numa fase prodrómica, com danos ligeiros cognitivos, devido a AD, foi possível detetar e quantificar TrkB-FL e TrkB-ICD. Notavelmente, foi possível verificar que pacientes numa fase prodrómica devido a AD apresentaram níveis significativamente elevados de TrkB-ICD no LCR, quando comparados ao grupo controlo (pacientes com danos ligeiros cognitivos, não atribuídos a AD). Em suma, os resultados obtidos neste projeto sugerem: 1) O TAT-TrkB atravessou de uma forma eficaz o modelo in vitro da BHE sem comprometer a sua integridade, e este péptido possui a capacidade de ser internalizado pela membrana celular dos neurónios; 2) O TAT-TrkB não promoveu danos cognitivos no comportamento normal em memória espacial em ambos os animais controlo e murganhos com AD (5xFAD); 3) Os níveis do fragmento TrkB-ICD como um possível biomarcador do LCR para a fase prodrómica de AD.

Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder considered as the most common form of dementia worldwide (60-80% of all cases). AD has three main stages: Preclinical stage, Mild Cognitive Impairment (MCI) and Dementia due to AD. This disease is characterized, among other molecular alterations, by the accumulation of Amyloid beta (Aβ) peptide in the brain, which leads to cognitive impairment, synaptic dysfunction and loss of endogenous neuroprotection. In AD, the signalling pathway mediated by Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is highly impaired, compromising the important physiological roles of BDNF in neuronal growth, differentiation, survival, and synaptic plasticity. Interestingly, decreased levels of BDNF and of the full-length isoform of TrkB receptor (TrkB-FL), alongside with increased levels of truncated TrkB (TrkB-Tc), dominant negative modulators of TrkB-FL, have been reported in the brain of AD patients. Recent studies explored in depth the main mechanism responsible for the impairment of BDNF/TrkBFL signalling in AD. It is now known that accumulation of Aβ peptide promotes an abnormal activation of N-methyl-D-Aspartate (NMDA) receptors, leading to increased intracellular Ca2+ levels, which promotes calpains overactivation, culminating in the cleavage of TrkB-FL. This mechanism generates two fragments: a membrane-bound truncated receptor (TrkB-T’) and an intracellular fragment (TrkBICD). TrkB-ICD is a stable fragment, which accumulates in the nucleus over time and promotes the phosphorylation of axonal and nuclear proteins. Importantly, it has been confirmed to be present in the brain of post-mortem AD patients. TrkB-ICD protein levels are increased along with a decrease in TrkBFL protein levels, in post-mortem brain samples, during AD progression. Remarkably, the host lab created a new drug to prevent TrkB-FL cleavage, the TAT-TrkB. One of the challenges of designing new drugs for AD treatment is the obligation that these drugs must reach the brain. Considering, that Blood-Brain Barrier (BBB) poses a limitation in drug development, it is important to create compounds able to suppress this restriction and reach the brain to exert its function. AD diagnosis has become an important field of research with a large evolution throughout the past few decades. Nowadays, the established cerebrospinal fluid (CSF) biomarkers, including Aβ1-42, total-tau (T-tau) and phosphorylated-tau (p-tau), allow diagnosis of patients together with clinical symptoms and imaging features (such as brain shrinkage). The urge to find biomarkers for an early stage detection, prior to the clinical symptoms, is vital to provide a better life quality for AD patients. However, up until now, this search has yet to be successful. Similarly, the currently pharmacological treatments available for AD patients are either symptomatic or palliative, not being able to reverse or halt the pathology. Therefore, the aims of this project were 1) to enlighten the therapeutic relevance of the TAT-TrkB and 2) to study the putative relevance of TrkB-FL and TrkB-ICD levels in human CSF as biomarkers for AD. Results collected in the present work show that TAT-TrkB is a peptide able to transverse the BBB without compromising its integrity. Moreover, this peptide is internalized in the neuronal cell membrane over time. Furthermore, TAT-TrkB did not lead to cognitive impairment in an animal model of AD (5xFAD) or in the control animals. Importantly, TrkB-FL and TrkB-ICD levels were detected in human CSF and remarkably TrkB-ICD levels were increased in the CSF of MCI due to AD, when compared to MCI group without AD manifestation. Taken together these data may suggest: 1) TAT-TrkB transverses the in vitro BBB, not compromising its integrity and it is internalized in neuronal cell membranes; 2) TAT-TrkB did not impair the normal behaviour in spatial working memory in either wild type and 5xFAD mice; 3) TrkB-ICD fragment as a possible CSF biomarker for prodromal AD.