Decellularized fetal muscle bioscaffolds as a tool to study the role of Laminin-211 in the MuSC niche

Abstract

A matriz extracelular é o componente não celular de todos os tecidos. Esta estrutura detém não só funções de suporte das células, mas também é um importante mediador de todos os processos biológicos necessários para o correto desenvolvimento dos organismos assim como na manutenção da homeostase. Cada tecido ou órgão apresenta uma matriz extracelular com uma composição distinta. Várias moléculas constituem esta matriz, e é a natureza modelar destas que permite a formação de estruturas com diferentes propriedades mecânicas e bioquímicas, permitindo uma grande diversidade funcional. O desenvolvimento de uma matriz extracelular específica para cada tecido resulta da interação entre células e microambiente, sendo um processo altamente dinâmico e em constante remodelação. A matriz extracelular pode ser dividida em duas principais categorias: a matriz intersticial e as membranas basais. A matriz intersticial é principalmente associada ao tecido conjuntivo e é constituída por proteínas como os colagénios intersticiais, a elastina, fibronectina e proteoglicanos. Estas moléculas atuam com substrato para as células, mas estão envolvidas também na regulação da adesão, migração, proliferação e diferenciação celular. As membranas basais localizam-se mais proximamente das células e devido a isso têm grande influência em como estas interpretam o seu meio. As membranas basais são constituídas essencialmente por colagénio tipo IV, lamininas, nidogénio e perlecan. À semelhança da matriz intersticial, regulam também processos celulares como a proliferação, diferenciação, migração, polarização e sobrevivência ou apoptose. As células recebem informação acerca do seu meio exterior através de recetores membranares. A matriz extracelular é um fator chave para o correto desenvolvimento de todos os tecidos. A miogénese do músculo esquelético é um exemplo de um processo altamente dependente de sinalização da matriz extracelular. O desenvolvimento do músculo inicia-se cedo durante a embriogénese dos vertebrados com a formação do sómitos. Estas estruturas crescem e desenvolvem-se originando o dermomiótomo. O dermomiótomo possui os percursores miogénicos que irão dar origem ao músculo esquelético. No estádio 8.5 o dermomiótomo “desepiteliza” e células musculares estaminais migram para o espaço abaixo dando origem ao miótomo, iniciando-se assim a miogénese do músculo esquelético. No miótomo desenvolvem-se os mioblastos que proliferam e fundem dando origem aos miotubos. Nesta etapa tanto a presença de fibronectina como de lamininas é crucial para o correto desenvolvimento destas estruturas. No miótomo, as células presentes sofrem diferentes processos reorganizacionais transformando-se em miofibras primárias. A miogénese primária ou embrionária ocorre entre o estádio 11.5 até ao 14.5, a partir do qual se inicia a miogénese secundária ou fetal que decorrer até ao nascimento. Esta fase de miogénese é caracterizada pelo aparecimento das miofibras. Durante a miogénese primária formam-se as miofibras primárias que estabelecem o padrão corporal do músculo esquelético. A miogénese secundária é caracterizada pelo aumento da massa muscular. Este crescimento pode ser dividido em duas fases: células musculares estaminais (Pax7-positivas) podem produzir novos mioblastos que fundem entre si (crescimento por hiperplasia) contribuindo para a formação de miofibras secundárias enquanto outras se diferenciam e fundem com as miofibras primárias levando ao seu crescimento (hipertrofia mediada por células). A ação conjunta destas duas fases leva a um crescimento tanto em número como em tamanho das fibras musculares. Para que este processo ocorra corretamente a presença de laminina-211 parece ser fulcral. A contribuição da matriz extracelular é muito importante para o desenvolvimento dos tecidos e devido a isso, quando esta se encontra perturbada, pode dar origem a diversas patologias. Quando a laminina-211 não está presente o desenvolvimento esquelético muscular é severamente afetado, dando origem à distrofia muscular congénita merosina-negativa (MDC1A), uma das distrofias musculares mais comuns na Europa. Esta condição é provocada por mutações no gene LAMA2, responsável pela codificação da cadeia α2 da laminina-221 e -221 levando à produção de uma proteína não funcional. Os portadores desta doença manifestam diversos sintomas como atrofia e hipotonia muscular, mas também o sistema nervoso parece ser afetado, entre outros sistemas de órgãos. Não existem ainda tratamentos eficazes para esta doença e a maioria do conhecimento existente é proveniente de informação pós-natal, não se conhecendo ainda o momento em que se origina esta condição nem os processos moleculares por detrás da mesma. Estudos anteriores no nosso laboratório revelaram que a origem desta doença poderá ser in utero durante a miogénese secundária, onde a ausência de laminina-211 parece levar a uma depleção precoce das células musculares estaminais, não permitindo que ocorra o crescimento das massas musculares. Este trabalho tem como objetivo acrescentar conhecimento acerca das dinâmicas celulares durante o desenvolvimento fetal desta doença e para isso foi utilizado o modelo de ratinho dyW/ dyW durante o estádio fetal 18.5. Inicialmente começou-se por caracterizar a composição da matriz extracelular de ratinhos normais e distróficos, recorrendo a imuno-histoquímica e western blot. Esta comparação parece demonstrar que a ausência de laminina-211 nos ratinhos distróficos poderá afetar também outras proteínas presentes na matriz extracelular. O colagénio I sofre um aumento de cerca de 3 vezes nos ratinhos mutantes. O aumento desta proteína está documentado em ratinhos após o nascimento e em associação a fibronectina, é responsável por processos inflamatórios e formação de tecido fibrótico (um dos principais sintomas da MDC1A), o que poderá indicar que este sintoma, apesar de não ser observado morfologicamente no feto, poderá iniciar-se ainda in utero. No entanto, contrariamente ao expectável, os nossos resultados parecem indicar que existe uma menor quantidade de fibronectina nos ratinhos mutantes. As lamininas parecem também sofrer uma diminuição em quantidade. Após a caracterização da matriz extracelular de ambos os genótipos, propusemo-nos criar um sistema que permitisse estudar a contribuição relativa das duas fontes de laminina-211 (células e matriz extracelular) para o normal desenvolvimento do músculo esquelético. Esta proteína já está presente no nicho das miofibras quando a nova onda de células musculares estaminais entra no programa miogénico. No entanto, estas células parecem também ser capazes de produzir laminina-211 e assim contribuir para a construção do seu nicho. O conhecimento da contribuição relativa de cada uma destas fontes para o normal desenvolvimento do músculo esquelético poderá permitir identificar e desta forma desenvolver terapias para determinados momentos fulcrais para este processo. A descelularização é uma técnica que permite a produção de matrizes extracelulares com uma composição semelhante à do tecido nativo sem a presença de células. Estas matrizes mantêm assim não só a composição química, mas também as suas propriedades mecânicas, o que permite uma maior aproximação ao in vivo, apresentando assim várias aplicações terapêuticas. Utilizando esta técnica testámos diferentes protocolos com objetivo de produzir uma matriz descelularizada que mantivesse uma composição semelhante à do músculo inteiro, mas sem células presentes. A utilização do detergente SDS a baixa concentração, em conjunto com outros compostos, permitiu manter na matriz extracelular a maioria das proteínas testadas (especialmente laminina-211) e apenas uma reduzida quantidade de conteúdo celular. No entanto, as matrizes descelularizadas parecem apresentar uma ligeira diminuição na quantidade de proteínas presentes após o protocolo de descelularização. Posteriormente estas matrizes descelularizadas foram cultivadas com células C2C12. Estas células são mioblastos pertencentes a uma linha celular imortalizada originada a partir de células satélite pós-lesão de ratinho, apresentando assim características de células musculares estaminais. A contagem do número de células, após 8 dias em ambos os genótipos, permitiu chegar à conclusão que estas matrizes eram capazes albergar e manter estas células. Os nossos resultados parecem mostrar uma tendência para a presença de um menor número de células nas matrizes descelularizadas mutantes, demonstrando que a ausência de laminina-211 poderá de alguma forma dificultar a adesão ou proliferação das células C2C12. Estas células são capazes de infiltrar nas matrizes e até de contrai-las, mudando-lhes a forma. As células parecem também adquirir propriedades características de células musculares diferenciadas (alinhamento e afunilamento dos núcleos) assim como também produzem e secretam diferentes proteínas da matriz extracelular como fibronectina, lamininas e especialmente laminina-211. Estes resultados podem indicar que células poderão ter a capacidade de recuperar um nicho incompleto como é o caso da MDC1A. Este trabalho permitiu estabelecer um sistema in vitro, que quando otimizado, poderá representar uma nova abordagem para a aquisição de conhecimento acerca das dinâmicas moleculares desta doença durante os estádios fetais, e no futuro, ajudar no desenvolvimento de novas terapias.

The extracellular matrix (ECM) plays a crucial role in myogenesis and when disrupted can originate various conditions. When laminin-211 is not present skeletal muscle development is severely impaired leading to Merosin-deficient congenital dystrophy type 1A (MDC1A). Previous works in our group shed some light on the possible origin of this condition occurring during in utero development, when secondary myogenesis is undergoing. The absence of laminin-211 seems to lead to an early depletion of the muscle stem cell pool impairing myogenesis. In this work we used embryonic day (E) 18.5 fetus of the dyW/dyW mice model and characterized the main ECM proteins in both wild-type and mutant mice. The comparison of both genotypes showed that the absence of laminin α2 may somehow perturb other proteins expression. After characterization, we aimed to produce a system that allowed to study the relative contribution of both sources of laminin-211 (ECM and cells) during skeletal muscle development. We decellularized fetal skeletal muscle, producing a decellularized matrix (dECM) with a similar composition to the native tissue (most importantly laminin-211) but depleted of cellular con-tent. A low concentration SDS treatment, among other component, was optimized to better fulfill this compromise. The dECMs of both genotypes were seeded with C2C12 myoblasts and the cell number and protein production were analyzed. Our results show a tendency to have fewer cells in the mutant dECMs, suggesting that the absence of laminin-211 may difficult C2C12 cells adhesion/proliferation. These cells were able to colonize and contract the dECMs and express different ECM proteins, including laminin-211, opening the possibility for cells to be able to recover a defective niche. This work results in the production of an in vitro model representing a possible novel approach to better understand the molecular dynamics of MDC1A and, in the future, the potential development of new therapies.