Unravelling the contribution of glial cells for the neuroinflammatory milieu of epileptic-like organotypic slices

Abstract

A epilepsia é uma das doenças neurológicas mais comuns, que afeta cerca de 65 milhões de pessoas por todo o mundo, independentemente da idade, género ou etnia. O termo epilepsia abrange vários distúrbios neurológicos genéticos e adquiridos, que têm em comum a periódica e imprevisível propensão para gerar episódios de atividade neuronal espontânea, sincronizada e excessiva. Esta doença neurológica crónica é também caracterizada pela quebra da barreira hematoencefálica, pelo aumento da excitabilidade e morte neuronal e por neuroinflamação. Alguns pacientes apresentam comorbidades, como défices de memória, depressão e transtornos do espectro do autismo. Ainda não existe cura para esta doença e, apesar de existirem vários fármacos antiepilépticos disponíveis, um terço dos pacientes continua a sofrer convulsões e deficit cognitivo. Para além disto, estes fármacos são maioritariamente sintomáticos, atuando nos neurónios, de forma a bloquear as convulsões. Assim, torna-se imperativo investigar o processo de epileptogénese, com o objetivo de encontrar novos alvos terapêuticos, que permitam prevenir o início e/ou progressão desta doença. Vários estudos têm demonstrado uma correlação entre a neuroinflamação e a epilepsia. Por um lado, as convulsões por si só induzem eventos neuroinflamatórios. Por outro lado, a neuroinflamação crónica e a libertação exacerbada de citocinas pro-inflamatórias, prejudicam a sobrevivência neuronal e a integridade da barreira hematoencefálica, contribuindo para a hiperexcitabilidade neuronal e para a diminuição do limiar para a ocorrência de convulsões. Este ciclo de feedback positivo tem sido observado em modelos experimentais de epilepsia e em tecidos de hipocampo removido cirurgicamente de pacientes com epilepsia. Atualmente, a neuroinflamação é considerada um potencial alvo terapêutico para esta patologia, principalmente para pacientes refratários às terapias já existentes. A via de sinalização do inflamassoma NLRP3, um complexo citoplasmático multiproteíco constituído pelos domínios NLRP3, ASC e Pro-caspase-1, é a principal via de sinalização envolvida no processamento de uma das principais citocinas pró-inflamatórias, a interleucina-1β (IL-1β), através da ativação da Caspase-1. A IL-1β libertada liga-se ao seu recetor nativo, IL-1R1, nas células neuronais e gliais, desencadeando cascatas de sinalização, que resultam na exacerbação da resposta inflamatória. A Caspase-1 ativada é ainda capaz de induzir morte celular por piroptose, através da clivagem da Gasdermin D (GSDMD). A ativação aberrante deste inflamassoma tem sido implicada num amplo espectro de doenças neurológicas, como a epilepsia. As células gliais, microglia e astrócitos, são consideradas as células imunes do Sistema Nervoso Central (SNC), onde desempenham várias funções, como sintetizar e libertar mediadores anti-inflamatórios e pró-inflamatórios. A interação microglia-astrócito, que ocorre na presença de um estímulo inflamatório, tem sido associada ao desenvolvimento e progressão da neuroinflamação em várias neuropatologias. As células da microglia são bastante heterogéneas e apresentam um pequeno corpo celular com inúmeras ramificações quando estão inativas. Após estimulação, iniciam o processo de gliose e tornam-se reativas, podendo apresentar dois fenótipos distintos, M1 ou M2. O fenótipo M1 tem uma aparência amoeboide, ou seja, um grande corpo celular com poucas ramificações/processos, elevada capacidade fagocítica, elevada mobilidade e produz mediadores pró-inflamatórios e neurotóxicos, como a IL-1β. Em contraste, o subtipo M2 tem uma aparência hiper-ramificada, produz mediadores anti-inflamatórios e está associado à reparação dos tecidos. Os astrócitos são parte integrante da sinapse tripartida e, tal como a microglia, participam nas respostas imunes no SNC. Estas células têm forma de estrela, com bastantes processos, que cobrem todo o SNC. Após estimulação, tornam-se reativos, através de um processo denominado por astrogliose, e também podem apresentar dois fenótipos distintos, A1 ou A2. Enquanto que os astrócitos A1, induzidos pela neuroinflamação, têm um perfil pró-inflamatório e são considerados neurotóxicos, os astrócitos A2, induzidos por eventos de isquemia, têm funções neuroprotetoras e reparadores no SNC. Recentemente, observou-se que as microglias M1 conseguem induzir o fenótipo A1 nos astrócitos, secretando as citocinas pró-inflamatórias IL-1α, TNF-α e C1q. Este estudo foi realizado num modelo de epileptogénese em fatias organotípicas de córtex rinal e hipocampo que, para além do hipocampo, também incluem o córtex rinal, composto pelo córtex perirrinal e entorrinal. Este modelo é uma ferramenta simples e útil no estudo da epileptogénese, pois permite preservar a arquitetura tridimensional do tecido, os contatos sinápticos, a comunicação entre neurónios e células gliais, a diferenciação e a maturação celular, bem como a conectividade neuronal e plasticidade sináptica, permitindo assim, a geração de atividade epileptiforme. Além disso, as fatias organotípicas podem ser mantidas por longos períodos de tempo, o que permite a sua manipulação e estudos a longo prazo. Este trabalho teve como objetivo caracterizar o contexto neuroinflamatório neste sistema e explorar o envolvimento da via de sinalização do inflamassoma NLRP3. Em última análise, este trabalho tentou avaliar se os astrócitos, por si só, conseguem manter e/ou propagar o contexto neuroinflamatório observado neste modelo de epileptogénese. Para atingir esses objetivos, vários tópicos foram avaliados ao longo de 21 dias de cultura: 1) a contribuição das células gliais para o contexto neuroinflamatório, por avaliação dos fenótipos reativos das células gliais; 2) a libertação da citocina pro-inflamatória IL-1β; 3) o padrão de expressão dos domínios do inflamassoma NLRP3 (NLRP3, ASC e Caspase-1) e de proteínas a ele associadas (GSDMD); e 4) o impacto da depleção da microglia no sistema, através de uma abordagem farmacológica. As fatias organotípicas foram preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley com seis a sete dias de vida (P6-7) e desenvolvem uma atividade epileptiforme a partir do dia 7 em cultura, através de uma privação gradual e controlada de soro no meio de cultura. Neste trabalho realizaram-se ensaios de imunohistoquímica (IHC), western blot (WB) e ELISA em amostras recolhidas a vários dias in vitro (DIV). Utilizou-se como marcador de microglia a molécula adaptadora de ligação ao cálcio ionizado-1 (Iba-1), para microglias reativas o cluster de diferenciação 68 (CD68) e para microglias reativas M2 o Ym1, também conhecido por Chitinase 3-like 3. Para os astrócitos, utilizou-se como marcador a proteína acídica fibrilar glial (GFAP) e para os astrócitos A1 o componente 3 do complemento (C3). Ao longo da cultura, ocorreu um aumento gradual de microglia M1, células Iba-1+/CD68+ de aparência amoeboide, nas regiões DG, CA3 e CA1 do hipocampo. Os resultados de WB indicaram um aumento na expressão de Iba-1, embora a expressão total de CD68 não tenha sofrido alterações significativas ao longo do tempo de cultura. Detetou-se igualmente a presença de células Iba-1+/CD68+ de aparência hiper-ramificada, sugestivo da presença de microglia M2, facto que foi corroborado por WB. A presença de astrócitos A1, células GFAP+/C3+ com o corpo celular volumoso e processos grossos, foi mais evidente nas regiões DG e CA3. Estes resultados foram corroborados por WB, que indicou um aumento significativo na expressão de GFAP. A expressão de dois fragmentos resultantes da clivagem de C3 (iC3b e C3dg) diminuiu, o que significa que as diferenças regionais obtidas por IHC tiveram impacto na expressão total obtida por WB. Os valores de IL-1β libertada aumentaram progressivamente até ao 17 DIV, sugerindo um aumento de ativação do inflamassoma NLRP3. A avaliação do padrão de expressão dos domínios do inflamassoma NLRP3, ao longo do tempo de cultura, não indicou diferenças significativas nos domínios ASC e Caspase-1. O domínio NLRP3 apresentou uma maior expressão no início da cultura, possivelmente pela indução da transcrição (priming) causada pelo dano inicial das fatias, como resultado do corte. Por último, a análise da morte celular por piroptose, foi realizada através do rácio entre o fragmento N-terminal da GSDMD (GSDMD-NT) e a GSDMD completa (FL-GSDMD). Os resultados sugerem preponderância de morte celular por piroptose nos tempos iniciais de cultura, não se tendo avaliado quais as células que estavam a morrer. Na segunda fase deste estudo, realizaram-se ensaios em que se procedeu à depleção da microglia das fatias organotípicas, por adição de PLX-3397 ao meio de cultura a partir de 3 DIV. Os resultados mostraram que o fármaco é eficiente na eliminação da microglia e sugerem que, à medida que a quantidade de microglia diminui, a proliferação e a reatividade dos astrócitos aumenta. Para além disto, resultados preliminares sugerem que a eliminação da microglia não afeta a libertação de IL-1β no sistema. Em conjunto, estes resultados confirmam uma ativação gradual das células gliais neste modelo de epileptogénese, provavelmente por ativação do inflamassoma NLRP3, e um consequente aumento na libertação da citocina pró-inflamatória IL-1β. A remoção das células da microglia do sistema parece não diminuir o contexto inflamatório, sugerindo que os astrócitos conseguem substituir a microglia e manter e/ou propagar, por si só, este contexto.

Epilepsy is one of the most prevalent neurological disorders that affects around 65 million people worldwide. The term epilepsy comprises several neurological disorders, characterized by a periodic and unpredictable propensity to generate spontaneous, synchronized, and excessive activity of neuronal populations, denominated as seizures. Unfortunately, epilepsy has no cure and although several antiepileptic drugs are available, they are not effective in one third of patients diagnosed with epilepsy. Thus, it is imperative to further investigate the process of epileptogenesis, to find new therapeutic targets to prevent the onset and/or progression of this disease. Several studies have demonstrated a correlation between neuroinflammation and epilepsy. Nowadays, neuroinflammation is considered a potential target for the development of new therapeutic drugs, especially for patients with refractory epilepsy. Glial cells, microglia and astrocytes, are considered the immune cells of the Central Nervous System (CNS) and the major players in neuroinflammation. Their interaction has been associated with the development and progression of neuroinflammation in several CNS-associated pathologies, and recently it was observed that M1 reactive microglia can induce the A1 neurotoxic phenotype in astrocytes, through the secretion of pro-inflammatory cytokines. The aberrant activation of NOD-, LRR- and pyrin domain-containing protein 3 (NLRP3) inflammasome, a cytoplasmic multiproteic complex composed by a sensor (NLRP3), an adaptor (ASC) and an effector (Pro-caspase-1), has been implicated in the development of many neurological diseases, such as epilepsy. This inflammasome is the main pathway involved in Interleukin-1β (IL-1β) maturation and release through Caspase-1 activation. The IL-1β released binds to its receptors in neuronal and glial cells, triggering signalling cascades, which exacerbate the inflammatory response. Activated Caspase-1 is also capable of inducing cell death by pyroptosis through the cleavage of Gasdermin D (GSDMD). This study was performed in a model of epileptogenesis in rhinal-cortex hippocampus organotypic slices, a model that resembles in vivo epilepsy and allows to record epileptiform activity and monitor the progression of epileptogenesis. The slices were prepared from six to seven-day-old Sprague-Dawley rats and they developed epileptic-like events, through a gradual and controlled serum deprivation in the culture medium. Therefore, this work aimed at better characterizing the neuroinflammatory context in this system, as well as the involvement of the NLRP3 inflammasome pathway. Ultimately, this work intended to disclosure if astrocytes alone could maintain/propagate the neuroinflammatory milieu observed in this model of epileptogenesis. To accomplish these goals, several topics were evaluated in epileptic-like rhinal cortex-hippocampus organotypic slices over 21 days of culture: 1) the contribution of glial cells for the neuroinflammatory milieu, by evaluating the reactive phenotypes of glial cells, 2) the release of the pro-inflammatory cytokine IL-1β, 3) the expression pattern of NLRP3 inflammasome domains (NLRP3, ASC and Caspase-1) and related proteins (GSDMD), and 4) the impact of microglia depletion via a pharmacological approach. Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule-1 (Iba-1) and cluster of differentiation 68 (CD68) were used as makers for microglia and reactive microglia, respectively. Ym1, also known as Chitinase 3-like 3, was used as the marker for M2 microglia. Astrocytes were identified through Glial fibrillary acidic protein (GFAP) expression, while A1 astrocytes upregulate the complement component 3 (C3). Throughout the culture, there was a gradual increase in M1 microglia, Iba-1+/CD68+ amoeboid cells in the DG, CA3 and CA1 regions of the hippocampus. WB results indicated an increase in the expression of Iba-1, although the total expression of CD68 has not changed significantly over the culture period. The presence of Iba-1+/CD68+ hyper-branched cells was also detected, suggesting the presence of M2 microglia, which was corroborated by WB. The presence of A1 astrocytes, GFAP+/C3+ cells with an enlarged cell body and tick processes, was more evident in the DG and CA3 regions. These results were corroborated by WB, which indicated a significant increase in GFAP expression. The expression of two fragments resulting from C3 cleavage (iC3b and C3dg) decreased, which means that the regional differences obtained in the expression of C3 by IHC had an impact on the total expression obtained by WB. The released IL-1β values increased progressively up to 17 days in vitro (DIV), suggesting an increase in NLRP3 inflammasome activation. The evaluation of the expression pattern of the NLRP3 inflammasome domains, over the culture time, did not indicate significant differences in the ASC and Caspase-1 domains. The NLRP3 domain shows a higher expression at the beginning of the culture, possibly due to transcription induction (priming) caused by the initial damage of the slices that resulted from the cut. Finally, the analysis of death by pyroptosis was carried out through the ratio between the N-terminal fragment of the GSDMD (GSDMD-NT) and the GSDMD full length (FL-GSDMD). The results suggest a preponderance of cell death by pyroptosis in the initial culture times, but which cells were dying was not assessed. In a second phase of this study, organotypic slices were depleted from microglia, by adding PLX-3397 to the culture medium from 3 DIV on. The results showed that the drug is efficient in the elimination of microglia and suggest that, as the amount of microglia decreases, the proliferation and reactivity of astrocytes increases. In addition, preliminary results suggest that microglia depletion does not affect the release of IL-1β in the system. Altogether, these results confirm a gradual activation of glial cells in this model of epileptogenesis, probably by NLRP3 inflammasome activation, and a consequent increase in the release of the pro-inflammatory cytokine IL-1β. Depleting the system from microglia does not seem to decrease the inflammatory context, suggesting that astrocytes become the leading inflammatory cell, being able to replace microglia and maintain and/or propagate the neuroinflammatory events.