Identification and characterisation of new players involved in the assembly of the meiotic spindle in Human oocytes

Abstract

A correta organização do fuso acromático é essencial para a segregação dos cromossomas durante a divisão celular. Durante a oogénese, os oócitos entram na meiose I, especificamente em prófase I, onde o material genético é condensado em cromossomas homólogos e se dá a recombinação. Estes oócitos ficam parados em prófase I até à puberdade. Com a puberdade, o aumento brusco da hormona luteinizante (LH) que ocorre todos os meses, estimula um oócito para recomeçar a meiose. Assim, o envelope nuclear começa a desintegrar-se, os cromossomas condensam e o fuso meiótico é organizado. Na etapa seguinte, metáfase I, o fuso meiótico alinha os cromossomas e migra para o córtex do oócito onde os cromossomas homólogos são segregados. Na meiose II, um segundo fuso meiótico é formado e os oócitos ficam parados em metáfase II até à fertilização. Com a fertilização, a meiose II é retomada e os cromatídeos são segregados. Assim, o fuso meiótico é responsável por separar os cromossomas, ou cromatídeos, de modo que metade seja corretamente colocada no corpo polar e extrudida, e que a outra metade fique no oócito. Por vezes ocorrem erros na segregação dos cromossomas ou cromatídeos, que podem ser causados por defeitos no fuso acromático. O fuso acromático é constituído por filamentos de microtúbulos (MT) nucleados por centros organizadores de microtúbulos (MTOCs, do Inglês Microtubule Organizing Centres). MTOCs são estruturas celulares que controlam a nucleação, estabilidade e ancoragem dos MTs. Em células eucariotas somáticas, os centrossomas são os principais MTOCs durante a divisão celular. Eles consistem em dois cilindros constituídos por MTs, chamados centríolos, e uma matriz pericentriolar (PCM). A PCM é uma massa constituída por várias proteínas que rodeia os centríolos e é essencial para a nucleação e ancoragem dos MTs. Durante a oogénese, a maioria das espécies, incluindo Humanos, eliminam os centrossomas e os MTs são organizados por MTOCs acentriolares. A maioria dos estudos sobre a oogénese em mamíferos são realizados em ratinhos. Neste modelo foram identificadas duas estruturas que compensam a eliminação dos centrossomas: os MTOCs acentriolares e os condensados LISD (Liquid Like Spindle Domain). Ambos os MTOCs acentriolares e os condensados LISD estão localizados nos polos do fuso meiótico, e ambos possuem na sua constituição proteínas da PCM. Os MTOCs acentriolares são responsáveis pela nucleação de MTs. Os condensados LISD também contêm proteínas reguladores de MTs como a AURKA, TACC3 e CHC17. Eles concentram as proteínas reguladoras de MTs à volta do fuso meiótico, permitindo que se difundam rapidamente nele. Perturbações nos condensados LISD, através de inibição ou depleção das proteínas mencionadas anteriormente, levam a defeitos no fuso meiótico e na segregação dos cromossomas. Em Humanos não se sabe muito sobre como o fuso meiótico é organizado. Um estudo demonstrou que os oócitos Humanos utilizam a via da Ran-GTP para nuclear os MTs. Isto foi demonstrado através do uso de um mutante que impede a Ran de executar a sua função. O uso deste mutante resultou em problemas na nucleação dos MTs e erros na organização do fuso meiótico dos oócitos Humanos. A via da Ran-GTP começa com o fator RCC1 a transformar a proteína nuclear Ran da sua forma ligada a GDP, para a forma ligada a GTP. O fator RCC1 está ligado à cromatina e a sua atividade gera um gradiente de Ran-GTP. Este gradiente induz a ativação de fatores de organização do fuso acromático, que por sua vez, participam na nucleação de microtúbulos ou estimulam a formação do fuso bipolar. Os oócitos Humanos têm sido considerados como não tendo MTOCs acentriolares óbvios. No entanto, um estudo recente identificou um MTOC, denominado huoMTOC, em oócitos humanos no estadío de vesícula germinal. Este huoMTOC é composto por quatro proteínas: TACC3, CKAP5, CCP110 e DISC1, e é um local de nucleação de microtúbulos, sendo necessário para a organização do fuso meiótico em oócitos Humanos. O huoMTOC é formado perto do córtex dos oócitos Humanos no estadío de vesicula germinal. Com o reinício da meiose, o huoMTOC migra em direção ao invólucro nuclear. Depois da rutura do invólucro nuclear o huoMTOC fragmenta e é recrutado pelos cinetocoros para a nucleação de MTs do fuso meiótico. Os autores também descreveram que mutações nos componentes do huoMTOC perturbam esta estrutura e levam a defeitos na organização do fuso meiótico. Aliás, pacientes com estas mutações demostraram problemas nos seus oócitos que levaram à paragem do desenvolvimento. Defeitos na organização do fuso acromático levam a erros na segregação dos cromossomas. Estes erros causam aneuploidias, uma condição onde a célula apresenta um número incorreto de cromossomas. Oócitos aneuploides apresentam severas disfunções celulares que, muitas vezes, causam problemas no desenvolvimento do embrião e a gravidez pára. Assim, aneuploidias são consideradas a principal causa de infertilidade nas mulheres, e insucesso nos tratamentos de fertilização in vitro. A infertilidade tem se tornado um problema de saúde crescente na nossa sociedade, e é observada muito mais frequentemente em Humanos que noutros mamíferos. Assim, ter conhecimento completo sobre os mecanismos para a organização do fuso meiótico em oócitos Humanos é fundamental para compreender as causas da prevalência de aneuploidias e infertilidade observados em Humanos. Com este objetivo em mente, selecionámos um grupo de proteínas para estudar. Estas proteínas candidatas foram descritas como tendo um papel importante na organização do fuso acromático noutros organismos, e estão presentes no proteoma e/ou transcriptoma de oócitos Humanos. Os candidatos incluem: 1) proteínas conhecidas como sendo necessárias para focar fusos acromáticos multipolares em fusos acromáticos bipolares, em linhas celulares Humanas cancerígenas. 2) proteínas motoras conhecidas por participar na organização do fuso acromático em mitose e em meiose. 3) proteínas conhecidas por estarem envolvidas na nucleação e/ou estabilização de MTs de forma independente do centrossoma. 4) proteínas que regulam a interação entre os MTs e a actina. O objetivo final é estudar estas proteínas através de imunofluorescência para investigar a sua presença e/ou localização em oócitos Humanos. Como é difícil obter oócitos Humanos em grande quantidade, perguntámos se poderíamos utilizar tanto oócitos frescos como oócitos vitrificados nas nossas experiências. Durante o processo de vitrificação, os oócitos estão expostos a nitrogénio líquido para os congelar rapidamente, sem formar gelo no interior do oócito. Durante este processo, os oócitos podem sofrer algum dano e por vezes degeneram e morrem. Desta forma, avaliámos se existem diferenças no citoesqueleto entre oócitos frescos e oócitos vitrificados. Para isto, olhámos para o fuso meiótico e outros marcadores através de imunofluorescência em ambas as condições. Nas nossas observações não detetámos diferenças entre oócitos frescos e oócitos vitrificados, em nenhum dos marcadores. Assim, podemos concluir que este processo de vitrificação não influencia o citoesqueleto de microtúbulos e que podemos utilizar tanto oócitos frescos como oócitos vitrificados na caracterização das proteínas candidatas. Para estudar as proteínas candidatas adquirimos anticorpos para cada uma e testámo-los em células de cultura Humanas, de modo a compreender se os anticorpos funcionavam corretamente usando o protocolo para oócitos. Com esta experiência conseguimos observar todas as proteínas em interfase e metafase, com localizações semelhantes às descritas na literatura. Assim, concluímos que os anticorpos funcionam com este protocolo e podem ser utilizados em oócitos Humanos. Desta forma, dispomos das ferramentas necessárias para iniciar a caracterização das proteínas candidatas em oócitos Humanos, e estudar os mecanismos de organização do fuso meiótico utilizados por Humanos durante a oogénese.

The proper organisation of a bipolar spindle is essential for correct chromosome segregation during cell division. The spindle is composed of microtubules (MT), that are usually nucleated by microtubule organising centres (MTOCs). Defects in spindle assembly often cause chromosome segregation errors that lead to aneuploid oocytes, with an incorrect number of chromosomes. Aneuploidies are considered the major cause of infertility and failure in infertility treatments. Thus, our main goal is to explore the mechanisms of spindle assembly in Human oocytes to better understand the causes of the high rates of aneuploidies and infertility observed in Humans. For this, we chose to study proteins that have been implicated in spindle assembly and MT nucleation in other organisms, as well as being present in the proteome and transcriptome of Human oocytes. Our aim is to assess their localisation in Human oogenesis. As large numbers of Human oocytes are hard to obtain, we proposed that both fresh and vitrified oocytes could be used for our experiments. As the vitrification process can potentially damage the oocyte, we tested if there were MT cytoskeleton alterations between fresh and vitrified Human oocytes. We did not observe any differences between the two conditions, suggesting that the vitrification process used does not affect the microtubule cytoskeleton. Hence, we can use both fresh and vitrified oocytes in the protein characterisation. Then we tested the antibodies for each protein candidate in Human cells to assess their performance with the protocol for oocytes. We looked at the proteins in interphase and mitosis and they presented localisations similar to the ones described in the literature. Thus, we concluded that our antibodies work with this protocol, and we can use them in Human oocytes. With these results, we are now equipped with the tools to start studying the protein candidates in Human oocytes.